Oligonucleótidos se puede utilizar para sustituir a un sitio concreto de un solo nucleótido de los genes diana transfectadas en ambos Anopheles gambiae Y Anopheles stephensi Células.
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Artículo de método
Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos
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Resumen
Resumen
Parásitos Plasmodium, el agente causante de la malaria, se transmite por la picadura de mosquitos anofeles infectados que resulta en más de 250 millones de nuevas infecciones cada año. A pesar de décadas de investigación, aún no existe una vacuna contra la malaria, destacando la necesidad de estrategias de control de la novela. Un enfoque innovador es el uso de mosquitos genéticamente modificados para controlar de forma efectiva la transmisión de parásitos de malaria. Alteraciones deliberadas de vías de señalización celular en el mosquito, a través de mutagénesis dirigida, se han encontrado para regular el desarrollo del parásito 1. A partir de estos estudios, podemos empezar a identificar posibles objetivos para la transformación genética. Mutagénesis dirigida se ha basado tradicionalmente en la recombinación homóloga entre un gen diana y una molécula de ADN de gran tamaño. Sin embargo, la construcción y el uso de tales moléculas de ADN complejo para la generación de líneas celulares transformadas de forma estable es costoso, lento y con frecuencia ineficientes. Por lo tanto, una estrategia de uso de ácido nucleico cerrado modificado-oligonucleótidos (LNA-ons) ofrece una alternativa útil para la introducción artificial sustituciones de un solo nucleótido en el gen episomal objetivos y ADN cromosómico (revisado en 2). LNA-ON mediada por mutagénesis dirigida se ha utilizado para introducir mutaciones puntuales en genes de interés en cultivos de células de levadura y 3,4 ratones. Mostramos aquí que LNA complementos pueden ser utilizados para introducir un cambio de nucleótido único en un objetivo episomal transfectadas que se traduce en un cambio de la proteína fluorescente azul (BFP) expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) de expresión, tanto en Anopheles gambiae y Anopheles stephensi células . Esta conversión se demuestra por primera vez que la mutagénesis eficaz de los genes diana en las células de mosquito puede estar mediado por LNA-ons y sugiere que esta técnica puede ser aplicable a la mutagénesis de los objetivos cromosómicas in vitro e in vivo.
Protocolo
- Antes de iniciar el protocolo, es importante para determinar que las células de mosquito utilizados en el experimento son saludables y en la confluencia ~ 80% si el tratamiento (Figura 1). Células cubierto o insalubres se traducirá en la eficiencia de transfección de baja y le dará los resultados inconsistentes.
- Calentar todos los medios de comunicación antes de su uso en un baño de agua de 28 ° C durante 30 minutos.
- A. stephensi MSQ43 células requieren E5 medio: MEM, w Earle / glutamina, 5% de FCS inactivado por calor, el 0,2% de D-glucosa, 1% de penicilina-estreptomicina, y el 1% no aminoácidos esenciales.
- A. gambiae cé....
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Discusión
Aquí presentamos un método in vitro y las pruebas para la conversión selectiva de un solo nucleótido en el gen episomal un objetivo después de la transfección de LNA-Ons en A. stephensi y A. gambiae células. LNA-ON mediada por la conversión de genes requiere la inducción de un sitio específico de la respuesta de reparación del ADN, nuestros datos indican que las células de mosquito puede apoyar este mecanismo de mutagénesis sitio-específica. Mientras que el método que aquí se presenta.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Abbie Spinner en el Centro Nacional de Investigación de Primates de California por su ayuda con la citometría de flujo. Este estudio fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH) AI073745, AI080799 y AI078183.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo de transfección Effectene | Qiagen | 301425 | |
| Plásmido control GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| Plásmido BFP (pcDNA5/FRT/TO) | Donado por el Dr. Concordet3 | ||
| ONs con anclaje de ácido nucleico bloqueado (LNA-ONs) | Donado por el Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s con glutamina | Invitrogen | 11095 | |
| Suero de ternera fetal (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Medio Drosophila de Schneider’s | Invitrogen | 11730 | |
| Aminoácidos no esenciales | Invitrogen | 11140 | |
| D-glucosa al 10% | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Antibiótico penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140 | |
| Placas de cultivo de 6 pocillos | Corning | 3516 |
Referencias
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueadoMutagénesis dirigidaTransfección de células de mosquitoExpresión de proteínas fluorescentesAnálisis por citometría de flujoDireccionamiento génico episomalCélulas de Anopheles gambiaeConversión de BFP a GFPPreparación del reactivo de transfecciónMonitoreo de la densidad celular
