Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

Resumen

A continuación se describe un ensayo que emplea el poder de la microinyección, junto con fluorescentes In situ con el fin de medir con precisión la cinética de la exportación nuclear de ARNm en células somáticas de mamíferos.

Resumen

En eucariotas, el ARN mensajero (ARNm) se transcribe en el núcleo y debe ser exportado al citoplasma para acceder a la maquinaria de traducción. Aunque la exportación nuclear de ARNm se ha estudiado ampliamente en los ovocitos de Xenopus ¹ y los organismos genéticamente tratables como la levadura ² y la línea celular derivada de Drosophila S2 ^3, pocos estudios se han realizado en células de mamíferos. Además, la cinética de la exportación de ARNm en células somáticas de mamíferos sólo se podía inferir indirectamente ^4,5. Con el fin de medir la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de cultivo de tejidos de mamíferos, hemos desarrollado un ensayo que emplea el poder de la microinyección, junto con la hibridación fluorescente in situ (FISH). Estos ensayos se han utilizado para demostrar que en células de mamíferos, la mayoría de los ARNm se exportan en forma de empalme depende ^6,7, o en la forma que requiera que las secuencias específicas de ARN como la región de la secuencia de codificación de la señal (SSCR) ^6. En este ensayo, las células se microinyección, ya sea con ARNm sintetizado in vitro o de ADN plásmido conteniendo el gen de interés. Las células se incuban por microinyección de diversos puntos de tiempo se fija y la localización subcelular de ARN se evaluó mediante FISH. En contraste con la transfección, donde la transcripción ocurre varias horas después de la adición de ácidos nucleicos, la microinyección de ADN o ARNm permite la expresión rápida y permite la generación de información precisa sobre la cinética.

Protocolo

Hay dos métodos de microinyección basado en que se pueden utilizar para medir la cinética de la exportación del ARNm en células de mamíferos, la inyección de ARNm sintetizado in vitro, o de ADN plásmido, que se transcribe en vivo en el ARNm. Cada técnica tiene sus ventajas e inconvenientes. Aquí se describen dos técnicas y discutir las diferencias entre los dos enfoques.

1. Preparación de materiales para la inyección

1. En el ARNm transcrito in vitro
   1. ARNm se transcribe a partir de cualquiera de los plásmidos o productos de PCR que contienen el gen de interés flanqueado aguas arriba por el promotor de la polimerasa de ARN apropiada (es decir, T7 o promotores SP6). La transcripción se lleva a cabo in vitro con la enzima apropiada (T7 o SP6 ARN polimerasa, Invitrogen) con nucleótidos apropiados y analógica tapa superior.
   2. Las transcripciones son poliadenilado in vitro usando Poly-A-polimerasa (Invitrogen) y el ATP de acuerdo a los protocolos del fabricante.
   3. El ARNm se purifica mediante columnas de cualquiera de Invitrogen o Qiagen.
   4. ARNm eluye luego se precipita por adición de volumen de acetato de potasio 1/20o 3M y 2 volúmenes de etanol al 100% a -20 ° C durante una hora, seguido por centrifugación a 13.000 g a 4 ° C durante 30 minutos. Si el exceso de líquido está presente, el pellet se pueden lavar con helado de etanol al 70%.
   5. El resultado de ARNm pellet se seca al aire solubilizado en buffer de inyección (140 mm HEPES 10 mM KCl y, pH 7,4). Tenga en cuenta que cualquier contaminante etanol puede ser tóxico para la célula de microinyección. El ARNm solubilizado se puede mantener a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
   6. Para la microinyección, el ARNm se diluye a 200μg/ml en tampón de inyección y se mezcla con Oregon Green 488 (OG) y conjugado con dextrano 70kDa (1mg/ml, Invitrogen). Dado que el dextrano conjugado OG-es demasiado grande para difundir a través de los poros nucleares, que permitirá no sólo identificar las células inyectadas, pero también ayudan a determinar la cantidad de líquido se inyecta en el núcleo y la cantidad de filtrado en el citoplasma ( ver 4.1.2). Por otra parte, una molécula fluorescente, de alto peso molecular que no es capaz de atravesar el poro nuclear puede ser utilizada.
   7. Las muestras se centrifugan a 13.000 g a 4 ° C durante al menos 20 minutos antes de cargar la aguja con el fin de pellets de cualquier partícula que potencialmente puede obstruir la punta de la aguja.
2. ADN plásmido
   1. ADN plásmido conteniendo el gen de interés puede prepararse con kits de purificación de ADN de Qiagen. Generalmente más grandes preparaciones de ADN tienden a ser de mayor calidad y por lo tanto se transcribe de manera más eficiente después de la inyección.
   2. El ADN del plásmido se diluye de 50 a 200μg/ml en tampón de inyección que contenga OG-70 kDa dextrano conjugado (1mg/ml).
   3. Antes de cargar la aguja, el líquido de la inyección se centrifuga a 13.000 g a 4 ° C durante al menos 20 minutos.
3. Agujas para la microinyección
   1. Las agujas se fabrican con tubos de 1,0 mm de vidrio de borosilicato capilares (Item # 1B100F-3, World Precision Instruments Inc.) utilizando una Sutter p97 Flaming / Brown Micropipeta Extractor con un filamento de 2,5 mm.
   2. Las agujas de inyección se generan mediante un programa de tres pasos de tiro con un filamento de 2.5x4.5 mm caja (artículo # FB245B, Sutter Instrument Co.). Los parámetros del programa utilizado en este experimento son los siguientes, sin embargo, debe ser optimizado para cada filamento.

      Paso #	Calor	Jale	Velocidad	Tiempo	Presión
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      (Temperatura de rampa = 740)
4. Preparación de células
   1. En general, cualquier línea de células de mamíferos se pueden microinyección, sin embargo los tipos de células que están bien distribuidos tienden a ser más susceptibles a la inyección. La elección de la línea celular también puede depender de otros factores. Por ejemplo, los ARNm que codifican para las proteínas secretadas se dirigen a la superficie del retículo endoplasmático y esto es mucho más visible en células COS-7, en comparación con los fibroblastos NIH 3T3 ⁶ (comparar la localización de T-Zona Franca-Δi ARNm en las figuras 3 y 4).
   2. Las células deben ser sembradas en cubreobjetos lavados con ácido cuadrados (25x25mm) en petridishes 30mm para al menos 24 horas antes de la microinyección. En líneas celulares de algunos, la difusión puede ser estimulada por las células de revestimiento en cubreobjetos recubiertos de fibronectina ^6,8. Lo ideal sería que la monocapa celular debe ser aproximadamente un 70-90% confluentes en el momento de la inyección.
   3. Para permitir la fácil identificación de las células inyectadas, la monocapa celular es herido antes de la inyección mediante el uso de una punta de pipeta de plástico 200μl. Por lo general una herida transversal (Figura 1) está grabado en el cubreobjetos y las células se dejan de recuperar por lo menos 15 minutos antes de la inyección en el tejido de la cultura incubadora.
   4. Durante la microinyección, los medios de cultivo de tejidos lentamente pierde CO ₂ a la difusión y como resultado se convierte en alcalino. Para ayudar a mantener un pH neutro durante la inyección, los medios de comunicación puede ser suplementado con HEPES 10 mM pH 7,4. El buffer extra puede ser añadido a los medios de comunicación el día antes de la microinyección.
5. El microscopio y Micromanipulador
   1. Las células son microinyección mediante un microscopio invertido que se encuentra aislada en una mesa de aire para minimizar las vibraciones que puede ser perjudicial para el proceso de microinyección. El microscopio está equipado con dos objetivos: un pedazo seco de 10x, que se utiliza para la posición de las células y la aguja, y un lugar seco 40x adicionales de larga distancia de trabajo objetivo de fase, que se utiliza para obtener imágenes del proceso de microinyección.
   2. Las aberraciones ópticas de visión causada por las células de todo el cubreobjetos y petridish puede ser eliminado si el objetivo tiene un collar de corrección. Asegurarse de que el microscopio de campo claro está correctamente alineado para la iluminación Köhler ^9, también le ayudará a corregir las aberraciones causadas por la luz que se dispersa por la aguja de inyección (ver 2.2.4).
   3. La aguja está controlada por un dispositivo de tres ejes colgando micromanipulación palanca de mando (NT-88-V3MSH, Narishige). El manipulador grueso se fija a la columna posterior del microscopio para permitir que la aguja sea fácilmente subir y bajar en el plato, manteniendo su posición original.
   4. La aguja se fija a una varilla que se sujeta al manipulador grueso. Un tubo se conecta el tubo a una jeringa de vidrio de 5 cc (Item # 512311, Becton Dickinson), que genera la presión de inyección necesaria para expulsar el líquido de la punta de la aguja de microinyección. Para controlar el nivel de presión, el cilindro de la jeringa y el pistón se mantienen en posición mediante un regulador de la jeringa que consta de dos tapones, una abrazadera (disponibles en cualquier ferretería) y dos abrazaderas de metal (Figura 2). Para asegurarse de que la jeringa se mantiene la presión alta, grasa de vacío (Dow Corning) se aplica al émbolo de la jeringa.
6. La sonda de hibridación fluorescente
   1. La secuencia primaria del ácido nucleico inyectado se dobla usando ARN secundaria software de predicción de la estructura, tales como RNAstructure 4,6 ^10.
   2. Los pliegues de ARNm son visualmente evaluados para identificar una región de aproximadamente 50 nucleótidos, que tiende a estar libre de estructuras secundarias, con temperaturas de fusión altos, tales como largos filamentos dobles.
   3. El complemento reverso de esta región se sintetiza con un fluoróforo Alexa546 unido al extremo 5 'de la sonda (que se pueden comprar en Integrated DNA Technologies).
   4. La sonda se diluye con agua a una concentración de 100μM y se almacenan a -80 ° C durante 2-3 años.

2. Microinyección intranucleares

1. Carga de la inyección de fluidos en el microscopio de microinyección
   1. Aproximadamente 1μl de inyección de fluidos es elaborado a partir del ADN de la muestra se centrifuga o ARNm utilizandoGELoader consejos (Item # 022351656; Epindorff). Líquido debe ser aspirado desde la parte superior de la muestra a fin de no perturbar el sedimento que contiene partículas que pueden obstruir la aguja.
   2. La punta de la pipeta se inserta en la parte de atrás de la aguja y el líquido se expulsa. Líquido se sentirán atraídos por la punta de la aguja por la acción capilar y un menisco cerca de la punta debe ser visible dentro de los 5-30seg.
   3. La aguja llena de líquido se introduce en el tubo, que luego se fija a la micromanipulador en un ángulo de 45 °.
   4. La aguja se visualiza con el objetivo de 10x y se coloca en el centro del plano de visión cerca del plano focal con los mandos de micromanipulador gruesa. La aguja se eleva entonces a unos pocos milímetros para evitar que sufra daños en fases posteriores (2.2.2) y luego el pilar del nuevo microscopio se empuja hacia atrás.
   5. La presión se incrementa en el émbolo de 0,5 2cc.
2. Microinyección
   1. A petridish contiene un cubre con una monocapa heridos se encuentra en la etapa de visualización.
   2. El pilar del nuevo microscopio se tira hacia adelante a una posición vertical, haciendo que el condensador para ser alineados y la aguja para entrar en el líquido. Esto debe hacerse con cuidado para evitar que la aguja se rompa en el cubreobjetos (ver 2.1.4).
   3. Utilizando el objetivo 10x, el centro de la herida cruz se identifica y se coloca la aguja por encima de las células que se inyectan.
   4. El aumento es mayor por el cambio con el objetivo de 40x y la aguja se baja y se centra con los mandos de ajuste fino en el joystick. Si la imagen está fuera de foco, se debe asegurar que la luz incidente está correctamente alineado (es decir, Kölher iluminación ⁹⁾ usando una lente de Bertrand (ver 1.5.2).
   5. La inyección debe comenzar en una esquina de la cruz de la herida y continuó a lo largo de un borde para facilitar la identificación de las células inyectadas en la visualización (ver Figura 1).
   6. La aguja se reduce a hacer contacto con el núcleo. Uno puede decir que una célula ha sido inyectada por el notable cambio en el brillo que acompaña a la fase de inyección.
   7. Si el líquido se llena toda la célula, se puede indicar que la presión es demasiado alta y debe ser reducido.
   8. Si no hay cambio en el brillo de la fase se detecta, esto puede indicar que, o bien la presión de microinyección no es lo suficientemente fuerte como para atravesar la membrana celular, o que la punta de la aguja está obstruida. Este puede ser el resultado de una serie de temas que incluyen: presión insuficiente, las imperfecciones en la aguja, y la obstrucción de la punta de la aguja con la materia de partículas pequeñas. Ya que cargar cada aguja en el micromanipulador es mucho tiempo, y dado que el sustrato de la inyección es a menudo muy valiosa, es importante para maximizar el porcentaje de las agujas que pueden ser utilizados eficazmente para preparaciones inyectables. A continuación se muestra una guía paso a paso para tratar de desbloquear una punta de la aguja está obstruido. Después de cada paso, se debe tratar de inyectar 2 3celdas para evaluar si la obstrucción se ha eliminado:

      	Acción	Propósito y Objetivo
      1	Ajustar el enfoque para ver la longitud de la punta de la aguja.	Para determinar si existe una imperfección evidente en la aguja, o si hay un pedazo grande de partículas bloquear la punta.
      2	Coloque la punta de la aguja al lado de un pedazo flotante de partículas en el plato.	Si el líquido está saliendo de la punta se debe agitar la partícula sin que entren en contacto directo con la aguja.
      3	El émbolo hasta el final de la jeringa	Este aumento temporal de la presión debe quitar cualquier obstrucción en la punta. Después de soltar el émbolo, se debe subir en su propio acuerdo, y si no lo hace, significa que esta presión no está siendo construida en la jeringa y hay que apretar las conexiones y / o añadir grasa de vacío adicional.
      4	Levante la aguja de la medicina celularia	La fuerza del dibujo de la aguja de los medios acuosos puede ayudar a desalojar las obstrucciones en la punta de la aguja.
      5	Retire el émbolo de la jeringa por completo y vuelva a introducirla.	Este incremento adicional de la presión puede ser requerido para eliminar la punta de la aguja.
      6	Rayar la punta de la aguja sobre una parte limpia del cubreobjetos	Esto además agita las partículas dentro de la aguja y ayuda a cambiar la posición de que para aliviar la obstrucción en la punta. Fuerte rascarse puede saltar fuera de la final de la punta, lo que permite la obstrucción de la salida de la aguja.
      7	Carga una nueva aguja

      
      
      Otro problema común es la pérdida gradual de la presión dentro de la aguja, lo que requiere una compensación más frecuentes por el émbolo de la jeringa. A menudo, la adición de grasa de vacío adicional para el émbolo de la jeringa puede ayudar a mantener la presión más consistente. Sin embargo, este problema puede ser debido a fugas de las conexiones entre la jeringa y el tubo, el tubo y el tubo, o la varita y la aguja. La mayoría de las fugas de aire pueden ser sellados con Parafilm (Fisher) o grasa si es necesario, aunque las fugas entre el tubo y la aguja sólo se puede corregir cambiando la junta de goma en el tubo.
   9. Las células a lo largo de un borde de la herida se microinyección a lo largo del borde de la herida durante un período fijo de tiempo (10-15min). Con la práctica de varios cientos de células pueden ser inyectados durante este intervalo.
   10. Después de la microinyección, las células se incubaron a 37 º C en un incubador de cultivo de tejidos para la cantidad deseada de tiempo antes de la fijación. Si la inyección de ADN, la transcripción se termina después de 20 minutos en el tratamiento de células con α-amanitina (1μg/ml, Sigma-Aldrich) disueltos en un medio de cultivo. Esta concentración efectivamente inhibe la transcripción del plásmido microinyección (Figura 3).
   11. Una sola aguja se puede reutilizar para inyectar cubreobjetos múltiples, aunque la aguja debe ser reemplazado cuando se cambia el tipo de ADN o ARN que es microinyección. Una vez que se retira la aguja de la varita se deben tirar y reutilizada no.
   12. Las células muertas o flotante de vez en cuando se adhieren a la punta de la aguja y puede interferir con la microinyección. Para eliminar estos restos de la aguja, levantar la aguja del líquido empujando hacia atrás la columna y luego, lentamente, vuelva a insertar la aguja en el líquido por el reajuste de la columna a la posición vertical.
   13. Para obtener una medida precisa de la exportación nuclear de ARNm medición cinética, muestras separadas se fije en 0min, 15min, 30min 60min y 120min microinyección post-ARN, o después de la α-amanitina tratamiento.

3. Fijación y la tinción de células

1. Fijación y permeabilización de células
   1. En el momento apropiado, los medios de crecimiento se aspira y se lavan las células dos veces con 2 ml de solución PBS (NaCl 137 mm, 2,7 mm de KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4). Es importante mantener el cubreobjetos húmedo, reduciendo al mínimo el tiempo que no se sumergen en un líquido.
   2. Las células se fijan mediante la adición de 2 ml de paraformaldehído al 4% (Ciencias microscopio electrónico) en PBS durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente.
   3. Las muestras fijadas se lavan dos veces con una solución de PBS.
   4. Las células se permeabilized con 2 ml de 0,1% Triton X-100 en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   5. Las muestras se lavaron dos veces con solución de PBS.
2. PESCADO tinción
   1. A continuación las muestras tienen que estar preparados para la hibridación. Las células se lavan dos veces con solución de SSC 1x (150 mM NaCl, 15 mM citrato de sodio, pH 7,0) con 25-60% formimide. Por la cantidad de formamida, utilice la misma concentración que está presente en la solución de hibridación (véase 3.2.3).
   2. Para preparar la cámara de manchas, el fondo de un petridish 150mm está cubierta de agua y un trozo de Parafilm está flotando en el agua. El agua se extrae girando el plato más, lo que permite la Parafilm para adherirse a la parte inferior del plato. Burbujas de aire manualmente removido.
   3. Para cada cubreobjetos que se cae de colores, 100μl de la solución de hibridación (25-60% formamida, 100mg/ml sulfato de dextrano, 1mg/ml E. coli tRNA, complejos 5mM ribósido vanadio en 1x SSC con sonda diluida 1:500) con pipeta a la parafina. Tenga en cuenta que la cantidad de formamida deben ser optimizados para la sonda de pescado en particular que se utilice.
   4. Con la ayuda de unas pinzas, un cubreobjetos se elimina de un petridish 30 mm, a continuación, utilizando papel de filtro Whatman (VWR) la parte de atrás (sin células lado) del cubreobjetos se seca y el exceso de buffer es malo desde el frente sin resecar la fija las células. El cubreobjetos se coloca boca abajo en la solución de FISH. Esto se repite para cada cubreobjetos.
   5. Después de colocar la tapa de la cámara tinción de nuevo, las muestras se incuban durante 5-18hrs a 37 ° C.
3. Lavado y montaje de la muestras teñidas
   1. Varias cámaras de lavado se realizan en la misma forma que la cámara de tinción (ver 3.2.2).
   2. Para cada cubreobjetos, 1 ml de tampón de lavado (1x SCC con 25-60% de formamida) se pipeta en la parafina de la cámara de lavado. Una vez más, utilizar la misma concentración de formamida que está presente en la solución de hibridación (véase 3.2.3).
   3. Para quitar el cubreobjetos de la cámara de tinción, 1 ml de solución de lavado es una pipeta al lado del cubreobjetos. El líquido debe ser dibujado debajo de cada muestra por capilaridad.
   4. El uso de pinzas, los cubreobjetos se retiran y cada uno se coloca sobre la gota de solución de lavado y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min.
   5. Pasos 3.3.2 a 3.3.4 se repiten dos veces más, para que cada cubreobjetos se lavan un total de 3 veces.
   6. Si el ARN se costained con un poco de proteína por inmunofluorescencia, consulte la sección 3.4.
   7. Las diapositivas se lavan con etanol al 70%, y se seca con Kimwipes. Para cada cubreobjetos, 10-30 l de solución de montaje con DAPI (Fluoromount G, el sur de Biotech) se pipeta en las diapositivas. Cada diapositiva puede acomodar a dos cubreobjetos.
   8. El uso de pinzas y papel de filtro Whatman, la parte de atrás de los cubreobjetos se seca y el exceso de líquido es malo fuera de la parte frontal del cubreobjetos sin secar las muestras. Cada portaobjetos se coloca boca abajo, sobre la gota de la solución de montaje.
   9. Muestras montadas se puede almacenar a 4 ° C.
4. La tinción de inmunofluorescencia
   1. Las muestras deben ser lavadas dos veces con PBS para eliminar formamida que puede interferir con la tinción de anticuerpos adecuado.
   2. Para cada cubreobjetos, 50μl de la solución de anticuerpo primario (anticuerpo 1.0μg/ml, el 0,1% TX-100, 0.1mg/ml RNasa libre de BSA en PBS) se pipeta en la parafina de una cámara de lavado.
   3. Con unas pinzas, cubreobjetos se colocan uno por celular en la solución de anticuerpo primario y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   4. Para cada cubreobjetos, dos gotas de 1 ml de PBS se pipeta en la parafina de una cámara de lavado.
   5. Para quitar el cubreobjetos de la solución de tinción de anticuerpos, 1 ml de PBS es una pipeta al lado del cubreobjetos. El líquido debe ser dibujado debajo de cada muestra por capilaridad.
   6. El uso de pinzas, los cubreobjetos se retiran y cada uno se coloca en la primera gota de PBS durante 5 minutos y luego se coloca en la segunda gota de PBS para otro 5 minutos.
   7. Pasos 3.4.2 a 3.4.6 se repiten con la solución de anticuerpos fluorescentes secundaria (anticuerpos 1.0μg/ml, el 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA en PBS). Tenga en cuenta que desde el marcador de la inyección y el ARN se pueden ver en el canal verde y el rojo, el anticuerpo secundario debe ser conjugado con un medio de contraste compatible como Alexa647.
   8. Cubreobjetos se montan como en 3.3.7.

4. Imágenes y cuantificación

1. Imágenes
   1. Un microscopio de epifluorescencia se utiliza la imagen de las células después de la inyección. Las células inyectadas se puede localizar mediante la localización de las heridas de la cruz y la identificación de las células con el marcador inyectado (OG-dextrano).
   2. Para cada celda observado, una imagen de la inyección OG-dextrano se adquiere. Cuando la imagen microinyección de ARNm es importante que la cuantificación se limita a las células que recibieron> 90% del fluido que se inyecta (por ejemplo, dextrano) en el núcleo.
   3. Una imagen de la ARN es adquirido. Para permitir la medición exacta de la ARN, el tiempo de exposición entre todas las células dentro de un curso determinado momento deben permanecer constantes y caen dentro del rango dinámico de la cámara. Lo ideal sería que cada imagen debe incluir una célula inyectados para poder calcular la correcta integración de fluorescencia de fondonsity (véase 4.2.4).
   4. Para ayudar en la cuantificación, la imagen de la mancha DAPI también se pueden adquirir. Además, si se realizó inmunofluorescencia, la proteína también puede ser manchada imagen. Un ejemplo de distribución de ARNm en varios puntos de un curso de tiempo se muestra en la Figura 4. El ARNm codifica una proteína secretada por lo que es dirigido a la sala de emergencias en células COS-7. Tenga en cuenta que la sala de emergencias de metas fue verificado por la co-tinción del ARN con anticuerpos contra TRAPα, un residente de la proteína ER ^11.
2. Cuantificación
   
   Esto se puede lograr con una serie de diferentes paquetes de software de análisis de imagen. ImageJ software es muy adecuado para la cuantificación de la distribución del ARNm celular, ya que puede ser utilizado para separar manualmente las fracciones nucleares y citoplasmáticas, se puede medir la fluorescencia media de estas fracciones, y sus datos de salida puede ser fácilmente copiado y pegado en otros programas, tales como Microsoft Excel.
   1. Imágenes correspondientes a FISH, OG-dextrano, y la fluorescencia DAPI se abren y se fusionaron con las imágenes en la pila de herramientas.
   2. Ya sea en la DAPI o capa de dextrano la herramienta umbral se utiliza para aislar el área correspondiente al núcleo de microinyección. Esta fracción se selecciona con la herramienta Varita, y después de mover a la capa de FISH, el área (A _Nuc) y la media / media intensidad (F _NUC) se registran utilizando la herramienta de medición.
   3. El perímetro de la célula se describe utilizando la herramienta de selección a mano alzada, y si bien en la capa PECES el área (A _Tot) y la media / intensidad media (F _Tot) se registran utilizando la herramienta de medición. Si su fluorescencia celular es mucho más intenso que el de los antecedentes, puede usar la herramienta umbral en lugar de la herramienta de selección a mano alzada para esbozar su celda deseada.
   4. Utilizando la función de selección rectangular, una caja se dibuja sobre una célula no inyectadas y la intensidad media / media (F _Volver) se registra.
   5. Todas las mediciones se copian en una hoja de cálculo Excel.
   6. ARNm exportados se calculan utilizando la siguiente ecuación:
      
      

      A Nuc	Área del núcleo
      A Tot	Área de toda la célula
      F Nuc	Media de fluorescencia de la fracción nuclear
      Tot F	Media de fluorescencia de la fracción de células enteras
      F Volver	Media de fluorescencia de una célula no transfectadas

      
      Para cada momento de la exportación% en promedio se calcula y se representa con el tiempo.
   7. la estabilidad del mRNA se calcula mediante el trazado de la media de fluorescencia total de ARNm (A x _Tot (F _Tot - F _Volver)) a través del tiempo. Por lo general nos encontramos con que cantidad de mRNA varía mucho entre las células y entre cubreobjetos. Esto puede ser debido a las inconsistencias entre las tasas de flujo de aguja y entre la eficiencia de la tinción de FISH.

Figura 1. Las células cubreobjetos microinyección. Se cultivan hasta que el 70-90% confluente entonces herido vertical y horizontal con una punta de pipeta de plástico 200μl. A partir de la cruz de la herida, las células se inyectan a lo largo de un borde de la herida (flecha).

Figura 2. Regulador de la jeringa. A) Diagrama de flujo que muestra cómo el regulador se monta jeringa. B) Esquema del aparato montado. C) Una fotografía de la jeringa regulador montado.

Figura 3. Efectos de la α-amanitina en la transcripción del ADN del plásmido se inyecta. NIH3T3 células de fibroblastos, que fueron pre-tratados con diferentes concentracioness de la α-amanitina, fueron inyectados con t-Zona Franca-Δi plásmido ADN y OG-conjugado dextrano 70kD. Las células inyectadas se incubaron a 37 º C durante 1 hora y luego se fijan y se tiñen de t-Zona Franca-Δi mRNA utilizando un PEZ probe6 específicos. Cada fila corresponde a un solo campo de visión de imágenes OG-70kDa dextrano y el ARNm de t-Zona Franca-Δi. Tenga en cuenta que las altas, bajas, pero no, las concentraciones de fármaco totalmente inhibida la producción de t-Zona Franca-Δi transcripción. Barra de escala = 15μm.

Figura 4. Por supuesto momento de la exportación del ARNm nuclear. COS-7 células fueron inyectadas con t-Zona Franca-Δi ADN plásmido y OG-conjugado dextrano 70kD. 30 minutos después de la inyección las células fueron tratadas con α-amanitina y se incuba a 37 ° C durante el tiempo indicado puntos. Las células fueron fijadas y teñidas con la sonda contra la T-Zona Franca-Δi ARNm y con anticuerpos contra el marcador ER TRAPα. Cada fila corresponde a un solo campo de las células. A) ARNm distribución después de una timecourse microinyección. B) Un golpe hasta el punto de tiempo de 120 minutos a partir de (A) que demuestran la co-localización de T-Zona Franca-Δi ARNm y la sala de emergencia. Una superposición de los ARNm t-Zona Franca-Δi (verde) y la tinción TRAPα (rojo) se muestra en el panel derecho. Las barras de escala = 15μm.

Discusión

Microinyección es una herramienta poderosa que puede ser usado para estudiar una serie de diferentes procesos celulares. A diferencia de la transfección de células convencionales, microinyección permite al investigador para introducir eficazmente los ácidos nucleicos en los núcleos celulares dentro de un plazo de tiempo muy estrecho. Como resultado, se pueden realizar análisis cinéticos como la determinación de las tasas de exportación del ARNm, la localización de mRNA y síntesis de proteínas. Además, dado que el plazo del experimento es relativamente breve, se puede exponer las células a los compuestos tóxicos en plazos cortos, sin incurrir en efectos pleiotrópicos. Por otra parte, los compuestos inhibidores o estimulantes, como las proteínas dominantes negativas, pueden ser co-inyectados con los ácidos nucleicos. Por último, microinyecciones de evitar la necesidad de reactivos de transfección, que suelen ser tóxicos para las células y puede perturbar diferentes funciones celulares.

ARNm frente a las inyecciones de ADN plásmido

La elección de qué ácido nucleico para inyectar dependerá de una serie de consideraciones. Después de la inyección de ADN plásmido, ARN polimerasa II no sólo sintetiza ARNm, pero también recluta factores proteicos a la transcripción naciente ^12,13. Como estos factores gobiernan los eventos tales como el procesamiento del ARNm, la exportación nuclear y la localización citoplasmática, las inyecciones de ADN del plásmido se puede utilizar para evaluar la forma en la transcripción se acopla a los procesos posteriores. A pesar de la transcripción se puede acoplar a la exportación nuclear ^14, hemos encontrado que el ARNm inyectado se exporta un poco más rápido que en el ARNm transcrito vivo ^6. Las razones para esto no están claras por el momento, pero este resultado puede sugerir que el ARNm de nueva síntesis se desprende de la ARN polimerasa II, puede ser invertido en complejos que retrasan las exportaciones nucleares.

Hay algunas ventajas con inyecciones de ARNm. En primer lugar, el investigador no tiene el uso de inhibidores de la polimerasa de ARN, que pueden afectar a cómo las células regulan el metabolismo general de la ARN. En segundo lugar, el ARN se puede modificar in vitro antes de la inyección. Por ejemplo, el ARNm puede ser sintetizado varios análogos con tapa 5 'o poli (A) longitudes de la cola con el fin de evaluar cómo estas características afectan a las exportaciones nucleares ^6. En tercer lugar, la cantidad exacta de ARN que se inyecta puede estimarse aproximadamente. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se estima que alrededor de 20.000 a 50.000 moléculas se inyectan en cada uno de los núcleos, que es relativamente pequeño en comparación con el número total de expedientes en una célula típica de mamífero (400.000 a 850.000 moléculas) ^15. La principal desventaja con las inyecciones de ARNm es que durante la microinyección, alguna fuga de líquido de la inyección en el citoplasma es inevitable. Desde el ARNm se inyecta directamente en el citoplasma es estable durante largos periodos (A. Palazzo, observación no publicada), el cuidado adicional se debe tomar para seleccionar las células que se han cuantificado. Generalmente se analizan las células que recibieron> 90% de la inyección de fluidos en el núcleo, según la evaluación de la distribución de la OG-dextrano.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de inyección	Sigma-Aldrich		140 mM KCl y 10 mM HEPES, pH 7.4
Dextrano Oregon Green 488-70kD	Invitrogen	D7173	El stock de 10 mg/ml en tampón de inyección puede almacenarse durante largos períodos de tiempo a -80°C
Tubos capilares de borosilicato	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Puntas de pipeta para carga de agujas de inyección	Eppendorf	022351656
Microscopio	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
Micromanipulador	Narishige International	NT-88-V3MSH
Jeringa para inyección	BD Biosciences	512311
Tampón PBS	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
Tampón SSC	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM citrato sódico, pH 7.4
Paraformaldehído al 4%	Electron Microscopy Sciences	15686	El stock de paraformaldehído al 37% se diluye en PBS
Triton X-100 al 0,1% (Surfact-Amps)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28314	El stock de Triton X-100 al 10% se diluye en PBS
Formamida	Fisher Scientific	F84-1
Sulfato de dextrano	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli ARNt	Sigma-Aldrich	R1753
Complejo de ribósido de vanadilo (VRC)	Sigma-Aldrich	R3380
Papel de filtro Whatman	VWR international	28298-020
Mesa con control de vibraciones	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-amanitina	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Tractor de micropipetas Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Grasa para vacío	Dow Corning	695400008
ARN polimerasa T7	New England Biolabs	M0251S
Poli(A) polimerasa	Ambion	AM1350
Tampón de hibridación	Sigma-Aldrich		100 mg/ml de sulfato de dextrano, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrato sódico, 0,5 mg/ml de E. coli ARNt, 60% de formamida