Summary
このプロトコルは、のための合成のtRNA基質の調製を記載し
Abstract
原生動物の寄生虫は寄生虫症による死亡の最も一般的な3つの原因のひとつであるアメーバ症、を含む種々の疾患を担当し、人間の最も破壊的な感染性病原体の一つです。食物や水で検出された感染性嚢胞と腸における侵襲栄養体の生活：アメーバ症のエージェントは2つのステージの下に存在するアメーバ原虫赤痢アメーバです。無症候性であることから大腸炎、赤痢や肝膿瘍のアメーバ症の範囲の臨床症状。E.赤痢は、そのゲノムの5 -メチルシトシン（5mC）との珍しい単細胞寄生虫の一つです。1、2、それはDnmt2ファミリーに属する単一のDNAメチルトランスフェラーゼ、Ehmethが、含まれている。2 Dnmt2の役割繰返し要素の制御にありE.年に設立されて赤痢 、3 キイロタマホコリカビ 4,5とショウジョウバエは 6我々の最近の仕事は、そのEhmethメチル化のtRNA Aspを示している、そしてこの発見は、この酵素は二重のDNA / tRNAのAspをメチルトランスフェラーゼ活性を有することを示しています。7この観察は、二重の活動と一致しているD.について報告されていることカビとD.キイロ 8 Dnmt2酵素のDNA / tRNAの特異性の機能的意義は依然として不明である。この問題に対処するために、Dnmt2タンパク質のtRNAメチルトランスフェラーゼ活性を決定する方法が確立されました。このビデオでは、我々はDnmt2ための十分なtRNAの基板を準備するために簡単なアプローチとそのtRNAのメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法を説明します。
Protocol
実験を開始する前に前提条件：
- RNaseフリー水はRNaseがによって分解されるRNAのリスクを軽減するために実験室でのRNAの処理で使用されています。この目的のために、水は通常37℃で少なくとも1時間、0.1％（v / v）のジエチルピロカーボネート（DEPC）で処理され° C、次にDEPCの跡を不活化する（少なくとも15分）オートクレーブ。
- Pipetmanピペットを使用する前にRNaseの除染液（RNaseの害虫駆除業者、Haemekベイト生物産業）で洗浄されています。
- エッペンドルフチューブとチップは、サンプルの整合性を維持するためにDNaseおよびRNaseの無料認定されるべきである。
1。 tRNAのASPの準備
このプロシージャは、任意のtRNAの合成に使用することができるin vitroでのランオフ転写で説明します。このプロシージャは、以前に発行されたリボザイム法を適応したものです。9は、この目的のためにテンプレートは、T7プロモーターと自己切断ハンマーヘッド型リボザイムと、必要なtRNAの相補的な配列からなるように設計されました。完全長のtRNAを5`- OHの代わりにリン酸化された5` - エンドので得られるような方法で5` - 最後に自分自身を切断する製品で、このテンプレートの結果の転写。完全長のtRNAは尿素- PAGEによって切断されたハンマーヘッド型リボザイムと未開の製品から精製することができる。
- PCRのプライマーとテンプレートのデザイン：
in vitro転写 T7 RNAポリメラーゼを介したための効率的なテンプレートを得るために3つの要件が満たされなければならない。- T7 -プロモーター配列（5'- TAATACGACTCACTATA - 3`）テンプレートに関与する必要があります。
- 転写効率を高めるために、転写されたRNAの最初の3つのヌクレオチドは、グアノシンにする必要があります。
- 特定のtRNAの正確な相補的な配列が必要です。
- PCR
テンプレートDNAの増幅のために、我々は、50μLの最終体積で標準的なPCR反応を使用。表1は、細部の最終濃度（反応氷上で調製した）とPCRのためのプログラムを。 DNAテンプレートへのフォワードプライマーの部分的にしか結合するための最初の10サイクルのアカウント中に使用される低いアニーリング温度。アニーリング温度を結合する非特異減らすためにすることはさらに25の増幅サイクルのために増加した。
テンプレートの増幅の成功は、アガロースゲルを1X GelRedソリューション（図2）でジウム1.3％テストされています。 - 転写
- T7のプレミックスを調製することができる5倍濃縮（200mMのトリス- HCl、pH 8.1、30 mMのMgCl 2、1mMのスペルミジン、5mMのDTT、2μg/ mLのBSA、0.01％トリトンX - 100）と、少なくとも1つのために使用された週、五凍結融解サイクル。
- 転写の混合物は室温で作製する必要があります。
- 転写反応は80μLのT7プレミックス、80μLのPCR産物、80μLのNTPミックスを（25mM）を用いて調製し、MilliQ水で385μLに調整した。 15μL（1.34 mg / mL）をT7 RNAポリメラーゼは（0.05μg/μLの最終濃度）反応を開始するために追加されます。
- 反応を37℃で4時間実施したピロリン酸の白色沈殿が成功した転写を示している。
- 精製
- ピロリン酸は、10,000 rpmで1分間スピンダウンした。
- 上清を使用して1つのボリュームformamidローディング色素を供給し、12％尿素- PAGEで精製した2時間20 W。ゲルのマウントを解除し、サランラップの上に置きます。
- 20分間0.1MのNaClを添加した3XGelRedソリューションでゲルを染色する。 UV励起時に、ラベル後の切除のための永久的なマーカーとサランラップでのtRNAバンド。また、予想される収量は50μgのバンドを超えている場合、UV -シャドウイングすることで見ることができます。 UV -シャドウイングの場合、蛍光薄層クロマトグラフィープレート上でゲルを置き、上からUV -ハンドランプを点灯。後で切除するため、ゲル中の非蛍光影（図3）として表示されるラベルのバンド、。
- tRNAのバンドは、メスで切除し、1.5mlのエッペンドルフカップに入れていた。
- 0.5M NH 4 OACサンプル450μLを添加した後、-80℃で凍結されている℃で2時間は、その後20℃でインキュベートし、一晩エッペンドルフThermoshakerで550 rpmで振とう。 6。手順5から上清NH 4 OACのソリューションは、このページの残骸を削除するには、8500 rpmで90秒を回転させ、Nanosepチューブ（孔径0.45μm）でろ過されています。
- 溶出したtRNAの降水量は、° C、純粋なエタノール（PA）、4℃、15500 rpmで-20℃で一晩と2.5時間の遠心分離におけるストレージ-80 2.5倍量を添加することにより実施した。
- 上清ペレットを除去した後SpeedVacで乾燥させ、MilliQ水で再懸濁した。
- 濃度は、光度計- ND1000を用いて測定した。 one 400μL転写の収率は80から100まで約500μgであった。
トラブルシューティング：
- いいえPCR産物はありません。 →は、互換性のあるプライマーと鋳型のシーケンスであり、反応混合物内のすべてのコンポーネントですか？
- いいえ転写産物いません。 →PCRが失敗だったかもしれない。正しいT7 -プロモーター配列。あまりにも冷たいソリューション反応を準備中。古すぎるT7プレミックス。
- ゲル上の製品が、なく溶出製品。純粋ではない、十分な降水量→エタノール寒さではない、ではない正しいボリューム。
2。組換え大腸菌の発現と精製E.における赤痢 Dnmt2（Ehmeth）プロテイン大腸菌 BL21
このプロトコルは、人間の10とショウジョウバエからDnmt2タンパク質の調製にも適しています。11
- E.赤痢 Ehmeth遺伝子は、PCRによって増幅pGEX 4NT1（GEライフサイエンス）にクローニングし、シーケンシングにより確認した
- 組換えプラスミドを大腸菌に形質転換された組換えタンパク質の発現用大腸菌 （BL21）。
- 形質転換された細菌は、ルリア - ベルターニ（LB）寒天アンピシリン（100μg/ mL）を培地上で選択した。 4〜5コロニーをピックアップし、適当な選択マーカー（100μg/ mLのアンピシリン）を含むLB培地5mlに接種し、37℃でオービタルシェーカーで一晩インキュベートした。℃に
- 一晩増殖培養は100μg/ mlのアンピシリンを含む2X酵母エキストリプトン（2XYT）培地500mlに接種し、37℃でオービタルシェーカーでインキュベートさせた文化のOD 600まで、Cは0.8に達した。
- Dnmt2組換えタンパク質の発現は、培養に0.5mMの最終濃度でイソプロピル-β- D -チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することにより誘導した。文化は、さらに24℃で16時間オービタルシェーカーでインキュベートした。インキュベーションの時間および温度は、封入体の形成を回避するために最適化されています。
- 培養は、4℃で遠心分離した° C、15分間200mLのNalgeneチューブで6,000回転、。上清を捨て、ペレットを少なくとも1時間、-70℃で凍結した。この凍結ステップでは、細菌の溶解性が向上。
- ペレットを溶解バッファー（100mMのKCl、1mMのDTT、1mMのPMSF、100μg/ mlのリゾチームとLeupeptine 100リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でμg/ mL）を30mLに収穫されました。この時点から、それは組換えタンパク質の失活を防ぐために、氷上でライセートを維持することが不可欠でした。ライセートは、設定なしで氷水浴中で超音波処理した。 MSE（ロンドン、イギリス）超音波処理（パワー高、振幅が5、30秒パルス、30秒5分の休憩）4。 Ehmethに取り付けることができる細菌のDNAを氷上で30分間、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Novagen社）治療（超音波処理ライセートの5 U / mL）で削除されました。溶解は4℃で30分間BugBusterのタンパク質抽出試薬（Novagen社製）°オービタルシェイカー（100 rpm）の上に穏やかに振とうさせながらCの300μL添加することにより完成しました。
- 組換えGST - Ehmethタンパク質は、製造指示（Sigma社）によるとグルタチオン - アガロース樹脂で変性条件下で精製した。ライセートを25 mLの場合、スラリーの樹脂ビーズを500μLを24で追加してインキュベートした℃で1時間。
- ビーズを溶解バッファー（ビーズの体積当たりの溶解緩衝液の10倍量）と冷PBSで6回で2回洗浄した。これらの広範な洗浄工程はelutio前ベンゾナーゼが残っていたことを保証しないn個のステップ。
- 組換えEhmethタンパク質は4℃で12時間グルタチオン溶出緩衝液5 mLを（トリスHCl、50mMのpH8.0の、グルタチオン（シグマ）を10mM）°穏やかに回転とCでビーズをインキュベートすることにより、グルタチオンアガロースビーズから溶出した。ビーズを遠心分離（2,000 rpm、5分間）により除去し、上清を回収した。
- 上清に溶出バッファーを保存バッファー（KClを200mMの、EDTA 10mMの、0.1mMのDTT、グリセロールPBS中60％）に置き換えられました。この目的のために、上清5mlをミリポアマイクロコンYM - 30遠心フィルターデバイス（コラムカットオフ30kDaの）上にロードされており、4℃で20分間8,000 rpmで遠心分離℃、濃縮物のタンパク質は、保存バッファー（5 mL）に希釈し、フィルターデバイス上でリロードされました。同じ手順は、ストレージのバッファにより溶出バッファーの完全な交換を保証するために少なくとも3回繰り返す必要があります。最終的に濃縮されたタンパク質は、ストレージバッファの約300μLで希釈してください。
- 組換えタンパク質の濃度は、Bradfordタンパク質アッセイによって測定した。組換え酵素調製物を-20℃で保存した。酵素の最終濃度は、メチル化アッセイに適した濃度として3μg/μLのを下回ってはいけません。
- タンパク質調製物をSDS - PAGEにより確認した。
注意：アクティブな酵素の準備を保証するためには、すべての精製工程は氷上で行われるべきとDTTを新たに調製し、保存バッファーに追加する必要があります。これは、6ヶ月間の活性酵素を保証する。
（3）in vitroでのtRNAのメチル化アッセイで
準備すべき溶液や試薬：
- トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの1M溶液。濃塩酸（HCl）で8.0に溶液のpHを調整します。
- 5Xメチル化バッファ（MB）：100mMのトリスpH8.0、100mMのNH 4 OAC、0.1mMのEDTA、10mMのMgCl 2。 MBは、ジチオスレイトール（DTT）することなく、事前に準備し、-20℃で保存することができます。
- 蒸留水の101.67 mLで5μLであるAdoMet（New England Biolabs社、32 mMの濃度）を混合することにより、非標識のS -アデノシルメチオニン（AdoMet）株式（終濃度1.5mMのを）準備する。
- 5％トリクロロ酢酸溶液（TCA）
- 100％エタノール
- サンプルバイアル当たりのシンチレーション液3 mLの。
アッセイ：
- ペッティングスキームは、メチル化アッセイ40μLの最終的なボリュームのために（表2）を調製する。
- 1.5mLのエッペンドルフチューブに、tRNAは5μMの最終濃度（1μgのtRNAのは40 pmolのと等価です）にDEPC処理水で希釈し、
- DTTの4μLを5XMBソリューションの8μLに（原液の濃度）を添加した。
- tRNAの溶液を2分間85℃でインキュベートし、ステップ3で調製した溶液をそれにすぐに追加されました。混合物を正しくtRNAの倍のように室温で15分間冷却した。
- AdoMetはミックス（最終濃度200μM）は、非標識AdoMetは150μMで標識AdoMetは50μM（250μCiの、10.0 CI /ミリモル、パーキンエルマー社）を混合することにより調製した。 10ラベリング反応に適したAdoMetはミックスのため、未標識であるAdoMet（希釈液から）、ラベルされたAdoMetは、蒸留水5.8μLの29μLの我々の混合5.2μL。
- 上記で調製したAdoMetはミックスの4μLのtRNAの溶液に添加し、37℃で2分間インキュベートした。
- tRNAのメチルトランスフェラーゼ、Ehmethは（1-10μMの最終濃度）のtRNA基質と標識ラベルなしAdoMetは補因子を含む溶液に添加した。混合物を37℃で3時間インキュベートした。チューブを穏やかにそれを反転させるインキュベーションの時間帯に定期的に混合した。酵素反応の速度論的曲線は、3時間かけて反応混合物からのサンプル（8μL）20分毎に取ることによって建てられました。
- 各サンプルは、直ちにワットマンフィルター（0.5 cmの直径）の中央にスポットされ、フィルタは（AdoMetはサンプルを除いて、すべきではない表2の列E 5％TCA溶液に浸漬し、氷上で10分間攪拌した）洗浄した。 5％TCA溶液による洗浄工程をさらに2回繰り返した
- フィルタは、10分間氷上で100％エタノールで洗浄した。
- フィルターは20分以上空気乾燥させた。
- それぞれの乾燥フィルターは、以前は次のシンチレーション液3mLの（CytoScint）を充填したチューブ（仕様）に置かれた
- tRNAのに取り込まれた放射能はシンチレーションカウンター（カウンターベータトライ炭水化物2100TR）を使用していました。
4。トラブルシューティング
- 列内の高い値は、AまたはB（表3）、制御のサンプル値は、列CまたはDのメチル化反応（表3）→フィルタが適切に洗浄されていないから期待されるものと類似していた。
- 列CまたはD（表3）の低値は、メチル化の実験では、列でコントロール反応に類似した値を持っているか、またはB（表3）→酵素がないAdoMetは取り込みがないことを意味し、正しく準備されていませんでした。別のオプションは、tRNAが劣化していると酵素に適した基質ではなかった、これはtRNAの整合性を調べるために尿素アクリルアミドゲル上でtRNAのサンプルを実行している（1.2参照）と臭化エチジウムでゲルを染色することによって確認できることです。 。
- Ehmethの活動が弱くなるので、列Dの低値（表3）→は、hDnmt2酵素の性能は、保存バッファーにDTT濃度を増加させることによって改善することがあります（1〜10mMの範囲で指定できます）するか、酵素濃度を増加させるために酵素の質の低さを緩和。
- 列Eの低値（表3）→この列には、この列の値が低い場合には、AdoMetは、もはやアクティブでないと、そのを失ったことを意味し、ラベルの付いたAdoMetは値（100％と呼ばれる）の合計放射能を表します。放射能。
5。代表的な結果
| 試薬 | 最終濃度 | PCR -プログラム | |||||
| Gentherm PCRバッファー | 1X | 1。 | 90 ° C | 2分 | |||
| MgCl 2の | 3.0 mmの | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTPミックス | 1.2 mmの | 2。 | 90 ° C | 30秒 | 5。 | 90 ° C | 30秒 |
| テンプレートDNA | 15.0 nMの | 3。 | 54 ° C | 30秒 | 6。 | 60 ° C | 30秒 |
| フォワードプライマー | 3.0μM | 4。 | 72 ° C | 45秒 | 7。 | 72 ° C | 45秒 |
| リバースプライマー | 3.0μM | 2 .- A - 4。 10サイクル | 5。 - 7。 25サイクル | ||||
| Taqポリメラーゼ | 0.1 U /μL | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | 広告50μlの | 蓋95 ° C | 8。 | 72 ° C | 3分 | ||
表1：PCRとPCRのプログラムのためのピペットスキーム。
| A 陰性コントロール （のみEhmeth） | B 陰性コントロール （のみのtRNA） | C 人間Dnmt2と陽性コントロール | D 標準反応 （エンツ+ SUBST + COF） | E フィルター上であるAdoMetの合計値 | |
| tRNAの | - | （3μg）を | （3μg）を | （3μg）を | - |
| hDnmt2 | - | （2.48μg）を | - | ||
| Ehmeth | （2.48μg）を | （2.48μg）を | |||
| メガバイト | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMetは | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| 合計 | 40μL | 40μL | 40μL | 40μL | 1μL |
表2：。スキームをペッティングの例は、スキーム内の各列は一つのサンプルを表しています。
* EhmethとhDnmt2両方は62 kDaの推定タンパク質のサイズを持つGSTタグと融合させた。
Ehmethのみを含むネガティブコントロール。
唯一のtRNAを含むB -ネガティブコントロール。
人間Dnmt2とC -ポジティブコントロール。この酵素はEhmeth十時間以上の活性を有している
酵素、基質や補因子を含むD -標準反応
フィルター上のAdoMetはのE -合計値。この値は、組み込まれたメチル基の割合の計算に使用されます。
| A 陰性コントロール （のみEhmeth） | B 陰性コントロール （のみのtRNA） | C 人間Dnmt2と陽性コントロール | D 標準反応 （エンツ+ SUBST + COF） | E フィルター上であるAdoMetの合計値 | |
| CPM | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
表3：。シンチレーションカウンターによって読み込まれる値の例は、スキーム内の各列は、表1から1のサンプルを表しています。
図1：（A）のT7転写鋳型とin vitro転写用プライマー 。全ての配列は、5方向'から3'に書かれています。カラーコード：テキストを参照してください。 転写時の生成物の生成 （B） スキーム 。 RNA転写産物はT7 RNAポリメラーゼによって合成される。ハンマーヘッド型リボザイムとtRNAの倍、それぞれの2次元構造へとリボザイムは、それらの5'末端（9時から適応）に水酸基を残しtRNAの自分自身を切断する。
図2：1.3％アガロースゲル上でPCR反応の制御は、1X GelRedでプレステつの異なるテンプレートのPCR反応は、100塩基対に加えてラダーと一緒に示されています。。コントロールには、"テンプレートのみ"車線とリバースプライマーが省略された反応が含まれています。
図3：UV -シャドウ 2つの転写混合物のPAGEの分離が示されています。彼らは蛍光TLCプレートに到達する紫外線を防止するので、前駆体の転写産物のバンド（切断前）、完全長のtRNAとハンマーヘッド型リボザイムは、影として見えるようになります。 E.から合計tRNAの大腸菌は、サイズマーカーとして使用されます。
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Discussion
本発表では、我々はE.のtRNAメチルトランスフェラーゼ活性の測定のためにアクティブコンポーネントを準備する方法を説明赤痢 Ehmeth酵素。この手順では、出発点として利用することもできますし、簡単に他のtRNAメチルトランスフェラーゼの測定に適応させる。酵素活性の最適な測定を保証するために、tRNAの基質のとtRNAメチルトランスフェラーゼ蛋白質の品質と整合性を維持する手順に従うことが重要です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
本研究では、イスラエル科学財団と医科学の研究のためのラパポートファミリー研究所、およびドイツ学術振興協会（DFG）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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