Implantación de cánula en la cisterna magna en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Xavier, A. L. R., et al. Implantación de cánula en la cisterna magna de roedores. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra el procedimiento para implantar una cánula en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La técnica consiste en guiar una cánula montada con aguja a través de la duramadre hacia la cisterna magna triangular invertida y asegurarla para su administración dirigida al líquido cefalorraquídeo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Procedimiento quirúrgico
   NOTA: La canulación crónica de la cisterna magna (CM) permite que los animales se recuperen del procedimiento quirúrgico. Las inyecciones de CM se realizan el día siguiente a la implantación de la cánula y, lo que es más importante, se pueden realizar en animales anestesiados o despiertos. Dado que se trata de una cirugía de recuperación, los procedimientos deben llevarse a cabo en condiciones estériles.
   1. Pesar el ratón (C57BL/6JRj, ambos sexos, 8 semanas) y anestesiarlo con una mezcla de ketamina y xilacina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Si es necesario, vuelva a dosificar al ratón con media dosis de ketamina (50 mg / kg) durante el procedimiento quirúrgico. Alternativamente, para la canulación crónica, anestesiar al ratón colocándolo en una cámara de inducción de isoflurano al 2,5 - 3% de isoflurano, a alrededor de 1 L / min de oxígeno (O₂). En este caso, use un cono nasal para mantener la anestesia con isoflurano al 1,5 - 2% durante toda la cirugía.
   2. Cuando cesen los reflejos de pellizco de los dedos de los pies y la respiración se vuelva lenta y constante, coloque al animal en un marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica.
   3. Aplique ungüento oftálmico. Repita durante la cirugía siempre que sea necesario.
   4. Afeite la cabeza y el cuello del ratón, quítele el pelaje y esterilice la piel expuesta primero con un hisopo con alcohol y luego dos veces con clorhexidina (0,5%) o solución de yodo (2%). Repita la esterilización dos veces más.
      NOTA: Cambie el paño quirúrgico para eliminar los desechos y el vello después del afeitado. Luego, cubra al animal para proteger el campo estéril.
   5. Para la canulación crónica, administrar 0,5 - 1 ml de lidocaína/bupivacaína (1 mg/ml y 0,25 mg/ml, respectivamente) por vía subcutánea (s.c.) en el sitio de la incisión. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg; s.c.) para la analgesia postquirúrgica.
   6. Fije el mouse en el marco estereotáxico. Después de asegurar la fijación, ya sea intraaural o por el arco cigomático, incline ligeramente la cabeza para que forme un ángulo de 120° con respecto al cuerpo (Figura 1E).
   7. Encuentre la parte del cráneo que sobresale inmediatamente por encima de los músculos del cuello: la cresta occipital. Levante la piel suprayacente con unas pinzas y corte un trozo de piel en forma de almendra de aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media. Use hisopos de algodón o lanzas oculares para controlar cualquier sangrado resultante.
   8. Usando la cresta occipital como punto de referencia, separe el tejido conectivo superficial para exponer los músculos del cuello debajo.
   9. Separe los músculos en la línea media pasando con cuidado las pinzas por el medio del sitio de la incisión en el eje anterior a posterior. Con un par de pinzas curvas en cada mano, una las puntas en el medio cerca de la parte inferior del cráneo y tire de los músculos hacia un lado.
      NOTA: Esto debe exponer el CM, que aparece como un pequeño triángulo invertido, delineado por el cerebelo arriba y la médula debajo, detrás de la membrana dural translúcida (Figura 1B y 1C).
   10. Con una lanza quirúrgica o un hisopo de algodón, limpie la membrana dural que cubre el CM.
2. Inserción de la cánula en la CM
   1. Retire la cánula de la jeringa llena de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF), manteniendo la aguja de 30G unida al extremo posterior del tubo.
   2. Conecte la aguja de 30G a una jeringa de 100 μL llena de agua destilada conectada a una bomba de jeringa.
   3. Introduzca una burbuja de aire de aproximadamente 1 cm en la cánula extrayendo aire con la ayuda de una bomba de jeringa.
   4. Con una bomba de jeringa, extraiga 12 μL del marcador de líquido cefalorraquídeo (LCR) deseado en la cánula.
   5. Sujete la cánula, llena con el trazador de LCR, cerca de la aguja cubierta por el tubo con un par de pinzas curvas sostenidas en la mano dominante. Apoye el dedo medio de la mano no dominante en la barra de la oreja del lado opuesto y manténgalo firme para usarlo más tarde como apoyo para la cánula.
   6. Inserte la cánula en un ángulo de 45 ° con respecto a la cabeza del ratón, pasando al centro del CM, identificado por su aspecto triangular visto a través de la duramadre. Evite cualquier penetración en el cerebelo o la médula. Asegúrese de que la aguja solo se inserte a una profundidad de 1 a 2 mm, como hasta el punto en que el bisel esté completamente debajo de la duramadre. Suelte las pinzas que sujetan la cánula y deje que la cánula descanse sobre la mano no dominante.
      NOTA: El extremo biselado de las agujas dentales requerirá la aplicación de algo de fuerza para perforar la membrana dural que cubre el CM.
   7. Si es necesario, seque cualquier fuga de LCR al penetrar con una lanza quirúrgica o hisopos de algodón.
   8. Aplique 2-3 gotas de pegamento de cianoacrilato sobre la membrana dural que rodea la cánula. Agregue una gota de acelerador de pegamento para curar el pegamento inmediatamente. Cubra el cráneo y la aguja con una mezcla de cemento dental (aproximadamente 0,5 mg) y pegamento de cianoacrilato (3 - 5 gotas). Inmediatamente después, aplique una gota de acelerador de pegamento para curar.

Resultados

Figura 1: Inyección de trazadores en la cisterna magna. (A) Visión general esquemática de la cabeza y el cerebro del ratón que muestra la ubicación de la cisterna magna (MC) en relación con el cerebro y las estructuras craneales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SOPIRA carpule 30G 0,3 x 12 mm	Kulzer	AA001
Clorhexidina 0,5% (digluconato de clorhexidina)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
Hisopo con alcohol 70% alcohol isopropílico 30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	Ophtha	145250
Aplicador de madera, bastoncillo de algodón doble (Ø aproximadamente, 4 - 5 mm, longitud aproximadamente, 12 mm)	Heinz Herenz	1032018
Lanzas oculares	Medicom	A18005
Kimtech Science toallitas de precisión limpiadores de tejidos	Kimberly Clark Professional	5511
Loctite super glue precision 5 g	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Acelerador Insta-Set CA	Bob Smith Industries	BSI-152
Cemento dental en polvo	A-M Systems	525000
Solución salina tamponada con fosfato (PBS; 0,01 M; pH 7,4)	Sigma Aldrich	P3813
Ovoalbúmina, conjugado Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) solución (1 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	62248
dextrano, fluoresceína, 3000 MW, aniónico	Thermo Fisher Scientific	D3305
Ketaminol Vet 100 mg/ml (ketamina)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 mg/ml (xilacina)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
Xilocaína 20 mg/ml (lidocaína)	AstraZeneca	158543
Marcain 2,5 mg/ml (bupivacaína)	AstraZeneca	123918
Bupaq Vet 0,3 mg/ml (buprenorfina)	Richter Pharma AG	185159