Inyección de células progenitoras neurales fluorescentes en organoides cerebrales humanos para modelado de trasplantes

Resumen

Fuente: Ibanez-Rios, M.I., et al., Un modelo de organoide cerebral humano de trasplante de células neurales. J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra la inyección de células progenitoras neurales (NPC) marcadas con fluorescencia en organoides cerebrales humanos utilizando una mezcla de matriz celular. El método es reproducible y libre de animales, lo que permite el trasplante con una interrupción mínima de los organoides. Ofrece una plataforma valiosa para modelar trasplantes neurales y enfermedades del sistema nervioso central (SNC).

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Inyección celular etiquetada en el organoide cerebral

NOTA: Para este artículo, los organoides cerebrales se produjeron utilizando un kit comercial según las instrucciones del fabricante. Esto se puede reemplazar con el organoide cerebral de interés. Los materiales utilizados en esta parte del protocolo deben enfriarse previamente para evitar la gelificación de la matriz de la membrana basal solubilizada a temperaturas superiores a 4 °C.

1. Coloque las jeringas, puntas y tubos de insulina que van a estar en contacto con la matriz de la membrana basal solubilizada a -20 °C para que se enfríen.
2. Descongele una alícuota de tamaño adecuado de matriz de membrana basal solubilizada en hielo, dependiendo del número de inyecciones que se vayan a realizar (~2 μL/inyección). Esto toma aproximadamente 30 minutos.
3. Mientras se descongela la alícuota, divida, coseche y cuente las células.
4. Calcule los volúmenes necesarios por inyección. Si realiza varias inyecciones, coloque el volumen total de células en un tubo de 1,5 ml y agregue hasta 1 ml de DMEM/F12.
   NOTA: Se debe utilizar un volumen que permita algunas inyecciones adicionales para tener en cuenta las pérdidas/errores de pipeteo.
5. Coloque las celdas en hielo mientras se preparan los siguientes pasos.
6. Después de la descongelación, diluya la matriz de la membrana basal solubilizada a una concentración final de 3 mg / ml en DMEM / F12 helado.
7. Tome la suspensión unicelular del hielo y gírela a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
   NOTA: Si no se dispone de una centrífuga refrigerada, generalmente parece tolerarse el centrifugado a temperatura ambiente.
8. Retire suavemente el medio por completo sin alterar el gránulo celular. Vuelva a suspender el sedimento celular mediante un pipeteo suave en la matriz de membrana basal solubilizada diluida (3 mg/mL) para obtener un volumen final de 2 μL por inyección a realizar, y vuelva a colocarlo inmediatamente en hielo hasta su uso.
   NOTA: La resuspensión de las células debe realizarse lentamente y con puntas preenfriadas para evitar la formación de burbujas y gelificación.
9. Transfiera las jeringas preenfriadas del congelador a -20 °C a un cubo de hielo. Guárdelos allí hasta su uso.
10. Retire la placa con los organoides cerebrales de la incubadora. Use una punta de gran calibre para transferir el organoide que se inyectará en un plato de 35 mm. Retire todo el medio posible sin dañar el organoide para estabilizarlo y facilitar la inyección.
    NOTA: Es importante utilizar puntas de gran calibre para evitar destruir el organoide. Si no están disponibles, corte el extremo de una punta P1,000 normal con tijeras estériles.
11. Coloque el plato de 35 mm que contiene el organoide bajo un microscopio de disección para ayudar a guiar y facilitar la inyección.
    NOTA: Si no se dispone de un microscopio de disección en un área estéril, es posible realizar la inyección sin uno, aunque con un control algo reducido. Otra alternativa es el uso de un lazo de aumento o gafas.
12. Una vez que los organoides estén listos para ser inyectados, vuelva a suspender suavemente las células con una punta de pipeta P20 fría y mueva 2 μL (que contiene el número deseado de células a inyectar) a un portaobjetos de vidrio estéril preenfriado.
    NOTA: Para inyecciones múltiples, se puede agregar un volumen adicional de 2 μL a través del portaobjetos de vidrio. Manténgalo en hielo y tenga cuidado de evitar la evaporación.
13. Tome una jeringa de insulina preenfriada del hielo y extraiga lentamente los 2 μL de suspensión celular con el bisel de la aguja hacia abajo para permitir que se absorban todas las células/medio.
    NOTA: Asegúrese de ir extremadamente despacio para evitar la inhalación de aire.
14. Abra la tapa del plato que contiene el organoide y enfoque el microscopio en él. Sostenga el plato con una mano. Coloque el bisel de la aguja hacia arriba y, con la otra mano, inyecte las células lentamente en la superficie del organoide.
    NOTA: Es importante inyectar lentamente para evitar dañar el tejido.
15. Después de la inyección, vuelva a colocar la tapa en el plato y deje reposar el organoide inyectado durante 1-2 min.
    NOTA: Esto permite que la matriz de la membrana basal diluida y solubilizada se gelifique, manteniendo las células en su lugar. Si el medio se agrega demasiado pronto, puede eliminar las células que se encuentran en la superficie.
16. Agregue suavemente 500 μL del medio organoide y transfiera el organoide con una punta de gran calibre a un pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar el organoide a 37 °C y 5% de CO₂ durante la noche. Realice cambios completos de medio cada dos días.
    NOTA: Es importante incluir un organoide de control negativo (simulacro de inyección), que se utilizará para los ajustes de imágenes. Para ello, inyecte un organoide como se describió anteriormente con matriz de membrana basal solubilizada diluida (3 mg/mL) para obtener un volumen final de 2 μL sin células.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM F12/Glutamax	Thermo	10565018
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	356231	Phenol Sin rojo, sin LDEV