El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Resumen

Este protocolo de vídeo se muestra el método de ensayo neuroesfera para generar y expandir las células madre neurales de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurarse de que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible.

Resumen

El aislamiento y la expansión de las células madre neurales putativo (NSC) del cerebro murino adulto fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss en 1992, empleando una química definida libre de suero sistema de cultivo conocido como ensayo neuroesfera (NSA). En este ensayo, la mayoría de los tipos de células diferenciadas mueren a los pocos días de la cultura, sino una pequeña población de células precursoras del factor de crecimiento de respuesta experimentan una proliferación activa en presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y / factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Estas células forman colonias de células indiferenciadas llamadas neuroesferas, que a su vez puede ser un subcultivo para ampliar el grupo de células madre neurales. Por otra parte, las células pueden ser inducidas a diferenciarse, generar los tres tipos principales de células de las neuronas del SNC, es decir, astrocitos y oligodendrocitos. Este ensayo proporciona una valiosa herramienta para proporcionar una fuente constante y renovable de los precursores del SNC no diferenciadas, que podrían ser utilizados para estudios in vitro y también con fines terapéuticos.

Este video muestra el método NSA para generar y ampliar NSCs de la región periventricular del ratón adulto, y proporciona una visión técnica para asegurar que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la extracción del cerebro del ratón adulto, micro-disección de la región periventricular, la preparación del tejido y la cultura de la NSA. El tejido es la primera cosecha químicamente digerido con tripsina-EDTA y luego disociado mecánicamente en un medio de NSC para lograr una suspensión de células individuales y, finalmente, se sembraron en la NSA. Después de 7-10 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes están listos para la subcultura de llegar a la cantidad de celdas requeridas para futuros experimentos.

Protocolo

Parte 1: Configuración básica antes de proceder a la disección:

1. Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente. Medio NSC también se pueden hacer en el laboratorio basado en la composición NSC medio de crecimiento publicados en la literatura ¹. Si su laboratorio no tiene mucha experiencia con la fabricación de medio, se recomienda utilizar medio disponible en el mercado que ha sido un control de calidad para el crecimiento NSCs antes de ser vendidos (como es el caso de NeuroCult, Technolgies de células madre).
2. El me....

Discusión

El ensayo neuroesfera ² ha ganado gran atención en la comunidad de investigación no sólo para el aislamiento y estudio de los comités directivos de la CNS ^05/04, sino también para el aislamiento de otros tipos de células madre putativa de numerosos tejidos, como el de mama ⁶ y ⁷ y el corazón para la identificación de cerebro, mama y colon células madre tumorales ^8-9 lo que sugiere que este sistema de cultivo se puede aplicar a una serie de síntomas somáticos y el tu.......

Materiales

* Para hacer HEM, mezcla 110L paquete de MEM and160ml de HEPES 1M y obtener un volumen de 8,75 L con agua destilada. Ajuste el pH final de 7,4 y almacenar a 4 ° C.