Cuantificación de amiloides inducidos por infecciones bacterianas mediante fluorescencia de tioflavina T

Resumen

Fuente: Balczon, R., et al. Métodos para detectar amiloides citotóxicos después de la infección de células endoteliales pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el protocolo para cuantificar amiloides en sobrenadantes de cultivo de células endoteliales pulmonares infectadas con bacterias virulentas, utilizando tioflavina T, un colorante fluorescente que se une a las estructuras de láminas beta amiloides. Un aumento en la fluorescencia en comparación con la línea de base indica la presencia de amiloides en el sobrenadante del cultivo.

Protocolo

1. Análisis de sobrenadantes citotóxicos

1. Para realizar un ensayo de tioflavina T (ThT), use la fluorescencia ThT para cuantificar los amiloides en los sobrenadantes. Para estas mediciones, use sobrenadantes esterilizados con filtro.
   1. Preparar una solución madre (50x) de ThT suspendiendo 8 mg de ThT en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de mezclar, filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las partículas.
   2. Para las mediciones, agregue 20 μL de stock de ThT a 1 mL de PBS en una cubeta de espectrofotómetro de 1 mL. Coloque la muestra diluida en un espectrofluorómetro.
   3. Mida la emisión de fluorescencia de referencia utilizando una excitación de 425 nm y escaneando la emisión de fluorescencia de 450-575 nm en incrementos de 2 nm.
   4. Realice un escaneo de lapso de tiempo utilizando excitación de 425 nm y emisión de 482 nm, con datos adquiridos cada 0,2 s durante 60 s.
   5. Los primeros 20 s del escaneo de lapso de tiempo miden la fluorescencia en la cubeta en blanco. A los 20 s, pausa la exploración y añade 10 μL del sobrenadante esterilizado por filtro a la cubeta. Mezcle la cubeta por inversión y luego vuelva a colocarla en el espectrofluorómetro.
   6. Reanude el análisis basado en el tiempo, adquiriendo los últimos 40 s de datos.
   7. Una vez finalizado el escaneo de lapso de tiempo, realice un escaneo final del espectro de emisión de fluorescencia utilizando configuraciones idénticas, como se detalla en el paso 1.3.

Materiales