Ensayo de coincubación para estudiar interacciones competitivas entre cepas bacterianas

Resumen

Fuente: Speare, L., et al. Ensayo de coincubación para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un ensayo de coincubación utilizado para estudiar cómo compiten las cepas bacterianas en un entorno compartido. Se aplica ampliamente en microbiología para identificar mecanismos, como la muerte dependiente o independiente del contacto, que impulsan estas interacciones.

Protocolo

1. Cepas en coincubación (Figura 1B, C)
   1. Mezcle la cepa de referencia y la cepa de la competencia en una proporción de 1:1 (v/v) agregando 100 μL de cada cepa (normalizada a OD 1.0) a un tubo de centrífuga marcado de 1.5 ml. Como control, mezcle la cepa de referencia con una versión etiquetada diferencialmente de sí misma (cepa de referencia pVSV102 + cepa de referencia pVSV208). Este control es necesario para un análisis estadístico posterior para determinar si la presencia de una cepa competidora afecta el crecimiento de la cepa de referencia. Agite el cultivo de cepas mixtas durante 1-2 s.
      NOTA: Este paso puede requerir optimización, ya que la relación inicial puede afectar significativamente los resultados y es posible que deba ajustarse.
   2. Repita el paso 1 para cada réplica biológica. Después de completar este paso, debe haber un total de ocho tubos de cepas mixtas: cuatro réplicas biológicas con cepas de referencia marcadas diferencialmente (control) y cuatro réplicas biológicas con cepas de referencia y competidoras marcadas diferencialmente (experimental).
   3. Detectar 10 μL de cada mezcla experimental y de control en placas de Petri que contengan agar LBS; Estos puntos de cultivo se utilizarán para microscopía de fluorescencia después de la incubación.
   4. Deje que las manchas se sequen completamente en el banco hasta que todo el líquido haya sido absorbido por el agar e incube las placas de Petri a 24 ° C durante 24 h. Se requiere un mínimo de 15 h para que las cepas de V. fischeri marcadas con pVSV102 y pVSV208 crezcan a una densidad celular lo suficientemente alta como para visualizar la proteína fluorescente verde (GFP) y la proteína fluorescente roja (RFP), respectivamente, a nivel de población utilizando un microscopio de disección de fluorescencia. Aquí, utilizamos una incubación de 24 h para obtener imágenes de puntos mixtos.
      NOTA: Es importante utilizar platos que no estén demasiado húmedos ni demasiado secos. Si las placas están demasiado húmedas, las manchas de coincubación no serán absorbidas por la placa de agar; Evite usar platos vertidos el mismo día. Si las placas están demasiado secas, se pueden formar pequeñas ondas o grietas en la superficie del agar, lo que hace que las manchas de coincubación tengan una forma irregular.

Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo que ilustra el ensayo de coincubación. (A) Las cepas bacterianas que albergan pVSV102 (cepa de referencia indicada Ref. Strain o R.S.) o pVSV208 (cepa de la competencia indicada Comp. Strain o C.S.) se cu...

Materiales