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1. Ensayo de chapado
NOTA: El ensayo de siembra mide la concentración de células capaces de generar una unidad formadora de colonias (UFC) en las muestras de cultivo. Este procedimiento revela la velocidad a la que una célula se divide en dos células viables y permite la detección de detenciones de división celular (por ejemplo, un aumento en el tiempo de generación bacteriana de la lisis celular).
- Preparar diluciones seriadas de 10 veces hasta 10-7 de los 200 μL de muestra de cultivo en medio fresco. Placa 100 μL de la dilución adecuada en placas de agarosa Luria-Bertani (LB) no selectivas para obtener entre 3 y 300 colonias después de la incubación nocturna a 37 °C. NOTA: La dilución seriada en medio fresco debe realizarse rápidamente para limitar las divisiones bacterianas. Alternativamente, los investigadores podrían considerar el uso de una solución salina sin una fuente de carbono para evitar divisiones celulares durante el proceso de dilución.
- Al día siguiente, cuente el número de colonias para determinar la concentración de células viables (UFC/ml) en cada muestra de cultivo. Grafique la UFC/ml en función del tiempo para cultivos celulares tratados y no tratados.
2. Citometría de flujo
NOTA: En la siguiente sección se describe la preparación de muestras celulares para el análisis de citometría de flujo. Esta técnica de análisis revela la distribución del tamaño celular y el contenido de ADN para un gran número de células. Cuando sea posible, se recomienda procesar las muestras de citometría de flujo inmediatamente. Alternativamente, las muestras se pueden mantener en hielo (hasta 6 h) y analizar simultáneamente al final del día, una vez que se hayan realizado las imágenes de placa y microscopía.
- Diluir los 250 μL de muestra de cultivo para obtener 250 μL a una concentración de ~15.000 células/μL (correspondiente a un OD600nm ~0,06) en medio fresco a 4 °C.
NOTA: La incubación en hielo limitará el crecimiento y la modificación morfológica de las células. Alternativamente, el usuario podría considerar realizar la fijación de las células en etanol al 75%, como generalmente se recomienda para la citometría de flujo. - Para la tinción de ADN, mezcle la muestra bacteriana con una solución de 10 μg/ml de colorante fluorescente de ADN (proporción 1:1) e incube en la oscuridad durante 15 min antes de analizar la muestra.
- Pase la muestra al citómetro de flujo con un caudal de ~120.000 células/min. Adquiera luz de dispersión frontal (FSC) y de dispersión lateral (SSC), así como una señal de fluorescencia de colorante fluorescente de ADN (FL-1) con los ajustes adecuados.
- Grafique los histogramas de densidad celular FSC y FL-1 para representar la distribución del tamaño celular y el contenido de ADN en la población celular.