Evolución adaptativa de bacterias mediante un sistema de cultivo de microgotas microbianas

Resumen

Fuente: Jian, X., et al., Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa mediante el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra el uso de un sistema de cultivo de microgotas microbianas para impulsar la evolución adaptativa de las bacterias hacia la tolerancia al metanol. Al mezclar cultivos bacterianos diseñados con un medio de alto estrés de metanol y segmentarlos en microgotas, el sistema selecciona mutantes que exhiben un crecimiento mejorado bajo estrés de metanol. A través de ciclos de enriquecimiento iterativos y aislamiento de colonias, las cepas bacterianas adaptadas al metanol se cultivan para su posterior análisis o aplicación.

Protocolo

Evolución adaptativa en MMC

1. Preparación para la solución bacteriana inicial
   1. Siga las regulaciones estándar relacionadas para preparar el medio líquido especial y las placas sólidas para el MeSV2.2 y el autoclave a 121 °C durante 15 min.
   2. Cultivar el MeSV2.2 utilizando la placa sólida (diámetro = 90 mm) en una incubadora de temperatura constante a 37 °C durante 72 h. A continuación, recoger una colonia independiente y cultivarla en un matraz de agitación de 50 ml con 10 ml del medio líquido especial en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 °C durante 72 h.
   3. Diluir la solución cultivada de MeSV2.2 con el medio hasta un DO₆₀₀ de 0,1-0,2 (asegurarse de que el volumen total no sea inferior a 10 mL) y continuar cultivándola en el matraz de agitación durante 5 h para obtener la solución bacteriana inicial.
      NOTA: El MeSV2.2 es una cepa de E. coli esencial para metanol. El medio líquido especial contiene 500 mmol/L de metanol, que es una fuerte tensión para MeSV2.2, lo que resulta en un crecimiento muy lento.
2. Inicialice la MMC.
3. Saque dos frascos de reactivos esterilizados, uno de los cuales es para la solución bacteriana inicial y el otro es para el medio fresco. Inyecte la solución bacteriana inicial (5 ml), el medio fresco (12-15 ml) y el aceite MMC en los frascos de reactivos.
   NOTA: Como la evolución adaptativa es un proceso a largo plazo que involucra múltiples subcultivos, almacene la mayor cantidad posible de medio fresco en MMC. El medio no se puede reponer durante el experimento.
4. Instale los dos frascos de reactivos en MMC. Instale uno para la solución bacteriana inicial entre el conector C2 y O2 y el otro para el medio fresco entre el conector C4 y O4.
5. Haga clic en ALE para elegir la función de evolución adaptativa (Figura 1B). En la interfaz de configuración de parámetros, active el interruptor OD Detection.

6. Establezca el Número como 50, la Longitud de onda como 600 nm, la Concentración como 0%, el Tipo como Tiempo, el Parámetro como 30 h y las Repeticiones como 99. Haga clic en Iniciar para iniciar la generación de gotas. Tardará unos 25 min.
   NOTA: Aquí, "Concentración" se refiere a la concentración máxima de factores químicos para la evolución adaptativa. Para diferentes gotas, es realizable en MMC introducir diferentes concentraciones de factores químicos para proporcionar diferentes condiciones de crecimiento. Calcule las concentraciones introducidas utilizando la siguiente ecuación:

   

   Aquí, "C" se refiere a la concentración de factores químicos introducidos en las gotas; "a" se refiere a la concentración de factores químicos en las botellas de reactivos entre el conector C4 y O4; "b" se refiere a la concentración de factores químicos en las botellas de reactivos entre el conector C6 y O6; y "i" se refiere a la concentración disponible. Hay ocho concentraciones disponibles en MMC. Dado que el factor químico aquí tiene una sola concentración (500 mmol/L de metanol) y es uno de los ingredientes del medio, aquí solo se instala una botella de reactivo que contiene el factor químico, y la concentración se establece en 0%. El tipo se refiere al modo de subcultivo, que se divide en tres tipos: modo de tiempo, modo de valor OD y modo de fluorescencia. El primero significa cultivar las gotas durante un tiempo fijo y luego subcultivarlas, mientras que las dos últimas significan cultivar las gotas hasta un valor de OD / intensidad de fluorescencia predefinido y luego subcultivar. El parámetro se refiere al parámetro relacionado requerido al elegir un modo de subcultivo. Las repeticiones se refieren al número de subcultivos.

7. Retire la botella de reactivo colocada entre los conectores C2 y O2.
8. Observe si los valores máximos de OD de las gotas durante cada período de subcultivo han aumentado significativamente. Si el aumento se produce y cumple con los requisitos del experimento, haga clic en el botón Exportación de datos para exportar los datos de OD.
   NOTA: Aquí, el período de subcultivo depende del Parámetro. Por ejemplo, al establecer Tipo como Tiempo y Parámetro como 30 h, el período de subcultivo es de 30 h. Durante cada período de subcultivo, hay valores máximos de OD de las gotas. Estimar si la evolución adaptativa cumple con los requisitos del experimento mediante el aumento de los valores máximos de OD (el aumento depende del proceso de cultivo real de la cepa, por ejemplo, aumentado en más del 20%). PRECAUCIÓN: Preste atención a si el medio fresco almacenado está agotado. Si el aumento significativo no se ha producido incluso después de que se agota el medio, extraiga las gotas de mejor crecimiento y lleve a cabo una nueva ronda de evolución adaptativa.
9. Extraiga las gotas de destino de la MMC.
   1. Haga clic en el botón Cribado para elegir la función de extracción de gotas (Figura 1C). Elija la opción Recopilar, haga clic en el número de gotas objetivo y luego haga clic en Aceptar.
      NOTA: El cribado de gotas incluye "Recolectar", "Desechar" y "Extraer solución de semillas". "Extraer solución de semillas" significa recolectar las gotas restantes después de la operación de subcultivo.
   2. Espere a que la ventana emergente le indique: "Saque el conector rápido CF y colóquelo en el tubo EP". Coloque el conector rápido CF en el tubo de microcentrífuga para su recolección de acuerdo con el mensaje del software y luego haga clic en Aceptar (Figura 2D).
   3. Después de 1-2 minutos, la interfaz del software abrirá una nueva ventana que le indicará: "Vuelva a insertar el conector y haga clic en Aceptar si ha terminado". Luego, vuelva a insertar el conector rápido CF y haga clic en Aceptar para que MMC continúe ejecutándose (Figura 2D).
      NOTA: Después de recolectar todas las gotas objetivo, la MMC continuará cultivando las gotas restantes. Si el cultivo no es necesario, haga clic en Detener para finalizar directamente la operación.
   4. Extraiga la gota con una pipeta de 2,5 μl, colóquela sobre la placa de agarosa de 90 mm y extiéndala uniformemente con una varilla de distribución de vidrio triangular con una longitud lateral de 3 cm. A continuación, cultívala en una incubadora a temperatura constante a 37 °C durante 72 h.
   5. Recoger de 3 a 5 colonias independientes y cultivarlas por separado en los matraces de agitación de 50 ml con 10 ml de medio fresco en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 °C durante 48-72 h. Siga las regulaciones estándar relacionadas para almacenar la solución de bacterias cultivadas en el tubo de glicerol para experimentos posteriores.

Resultados

Figura 1: Interfaz del software de operación de MMC. (A) La interfaz principal del software. (1) Temperatura en la cámara de operación. (2) Valor de la señal fotoeléctrica del reconocimiento de gotas. Cuando pasa la got...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Metanol	MACKLIN	M813895	Componente del medio especial para MeSV2.2.
Sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Realización de determinación de la curva de crecimiento y evolución adaptativa. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Chip microfluídico	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Para diversas operaciones de gotas. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Aceite MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La fase oleosa para microfluidos de gotas. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Placa de Petri	Corning Incorporado	90 milímetros	Para la preparación de medio sólido
Pipeta	eppendorf	2,5 μl, 10 μl, 100 μl, 1000 μl	Para la manipulación de líquidos
Conector rápido A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Para la conexión de cada junta. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Frasco de reactivo	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Muestreo y almacenamiento de solución y reactivos bacterianos. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Agitar el matraz	Unión-Biotecnología	50 ml	Para cultivo microbiano
Incubadora de agitación	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Para el cultivo microbiano en matraz de batido
Sulfato de estreptomicina	Solarbio	S8290	Componente del medio especial para MeSV2.2.
Jeringa	INSTRUCCIÓN MÉDICA JIANGSU ZHIYU CO., LTD	10 ml	Extraiga líquido e inyéctelo en la botella de reactivo
Aguja de jeringa	Ferretería OUBEL	22G	El diámetro interior es de 0,41 mm y el diámetro exterior es de 0,71 mm.