Preparación de una placa microfluídica con células bacterianas

Resumen

Fuente: Sutlief, A. L., et al. Análisis de células vivas del esfuerzo de cizalladura en Pseudomonas aeruginosa utilizando un sistema microfluídico automatizado de mayor rendimiento. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demuestra la preparación de una placa microfluídica para estudios de esfuerzos cortantes en cultivos bacterianos. Tras cebar los canales con un medio, se introducen células bacterianas en el canal experimental e incuban para su inserción. Se retiran medios residuales y cultivos para preparar el sistema para posteriores experimentos de esfuerzo cortante.

Protocolo

1. Preparación de medios

1. Prepara un medio mínimo (MM) con 0,25% de glucosa. Para obtener 1 L de MM con 0,25% de glucosa, añadir 200 mL de solución salina estéril M9, 2 mL de sulfato de magnesio estéril de 1 M (MgSO₄), 100 μL de cloruro de calcio estéril de 1 M (CaCl₂) y 12,5 mL de glucosa estéril al 20% (p/v) al agua (dH₂O) a un volumen final de 1 L.
2. Transfiere el medio necesario a una botella estéril usando técnicas estériles. Prepara la cantidad requerida según el número de canales que se utilicen. Normalmente, cada canal requiere 200 μL para el cebado, 300 μL para la siembra y 1300 μL para el experimento de 24 horas.
3. Coloca la botella en una incubadora o baño maria a temperatura experimental. El medio debe estar a la temperatura del experimento antes de su uso para evitar la formación de burbujas en los microcanales.

2. Preparación de un cultivo nocturno y experimental de la cepa PA01 de Pseudomonas aeruginosa que exprese una proteína fluorescente verde mejorada (PA01-EGFP).

1. Colocar 15 mL de material experimental en un matraz estéril y inocular con una o dos colonias de una placa de agar estrenada con PA01-EGFP. Expande el cultivo durante 12-16 horas sobre una incubadora/mesa agitadora a 37 °C y 180-220 rpm.
2. Mide el OD₆₀₀ de la cultura nocturna. Cuando el OD₆₀₀ sea superior a 0,80, diluir el cultivo nocturno hasta un diámetro exterior final de 0,8 usando MM fresco. Colocar el cultivo experimental en una incubadora o baño maria a 37 °C hasta que sea necesario para sembrar los canales microfluídicos. Revisa el OD₆₀₀ inmediatamente antes de la siembra para asegurarte de que no ha cambiado significativamente respecto al OD₆₀₀ objetivo, 0,8 en este caso.

3. Arranque de equipos

1. Configura la estación de sistema según la guía de usuario, similar a la configuración de la Figura 1. Para evitar un error en la conexión del instrumento al software, enciende el instrumento en el siguiente orden:
   Estación de trabajo PC
   Módulo de fluorescencia. Asegúrate de que el obturador de fluorescencia esté ENCENDIDO (luz azul junto al botón del obturador encendido).
   Controladores de hardware
   Controlador de sistemas de imagen (véase Tabla de Materiales)
   Cámara CCD
   Estación de imagen (microscopio)
   NOTA: La temperatura de la placa calentada debe ajustarse a la temperatura experimental deseada.
2. Inicia la aplicación de control e introduce el número de matrícula que aparece en la etiqueta lateral de la placa.
   NOTA: Tras el inicio de la aplicación de control, habrá dos ventanas de aplicación separadas, una para el software que controla el microscopio/software de imagen y otra para el módulo de control que controla la bomba y la interfaz de la placa del pozo.

4. Imprimado y siembra de la placa microfluídica

NOTA: El cebado, la siembra, la unión bacteriana y el crecimiento se ilustran en la Figura 2.

1. Retira la placa microfluida de 48 pozos del envase asegurándote de no tocar la superficie de vidrio en la parte inferior de la placa. Limpia bien la llave de vidrio en la parte inferior de la placa con un papel de lente, un paño sin pelusa o una toallita de baja pelusa.
2. Para cebar los canales microfluídicos, se pipetean 200 μL de 37 °C MM en el pozo de salida, teniendo cuidado de evitar burbujas. Coloque la placa en la etapa de placa y limpie la interfaz con etanol, dejando que se seque, antes de sellarla en la etapa de placa.
3. En modo manual en el módulo de control, se configura Fluido como
   luria-bertani (LB) a 37 °C y Cizallamiento máximo a 5,00 dyne/^{cm 2}. Haz clic en los pozos de salida para activar el flujo de salida al pozo de entrada, preparando los canales. Tras la imprimación de 5 minutos, pausa el flujo para prepararte para la siembra. Retira cuidadosamente la placa de la etapa y pipetea el medio residual de la salida, pero no retires ningún medio del círculo interior que conduce a los canales microfluídicos.
4. Para sembrar los canales experimentales, primero se pipetean 300 μL de MM en el pozo de entrada, seguido de pipetear 300 μL del cultivo bacteriano en el pozo de salida dentro del pozo de salida. Coloca la placa de nuevo en la etapa de placa, asegurándote de limpiar la interfaz antes de colocarla sobre la placa.
5. En el Módulo de Control, enfoca en un solo canal usando la transmisión en directo de la cámara después de colocar la etapa de placas sobre la etapa del microscopio. Mientras se monitoriza visualmente mediante la transmisión en vivo, reanuda el flujo a 1,00-2,00 dyne/cm² durante aproximadamente 2-4 s para permitir que las células entren en el canal experimental, pero no en los canales serpentinos. Deja la placa en la etapa controlada de temperatura durante 1 hora para permitir la fijación de la celda. Durante la incubación de 1 hora, se puede configurar el Módulo de Control y el software de montaje para el autorun.
   NOTA: El tiempo necesario para la siembra variará según el medio y el organismo, por lo que debe ser monitorizado de cerca por la alimentación en vivo hasta que esté optimizado y se utilice como un periodo de tiempo general. La siembra a lo largo de la placa puede variar, lo que requeriría más tiempo para que la siembra aplicada fluya hacia ciertas columnas de canales para la siembra completa.
6. Tras el periodo de inserción, retira suavemente la placa de la etapa y pipetea primero las bacterias de la salida, evitando alterar el canal. Con una nueva punta de pipeta, retira el medio de los pozos de entrada.

Resultados

Figura 1: Componentes individuales del Sistema Microfluídico. Los componentes individuales se enumeran de izquierda a derecha: 1. Cámara CCD, 2. Microscopio invertido de alta resolución con escenario automatizado, módulo de fluorescencia au...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de amonio, ACS	VWR	BDH9208-500G	Parte de la composición mínima de medios
Placa de cizalladura baja de 48 pozos BioFlux 1000	Fluxion Biosciences	910-0047
Sistema de Imagen Microfluídica BioFlux 1000Z	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Dihidruro de cloruro de calcio, grado ACD	VWR	97061-904	Parte de la composición mínima de medios
Dextrosa, anhidro, ACS	VWR	BDH9230-500G	Parte de la composición mínima de medios
Sulfato de magnesio grado ACS	VWR	EM-MX0070-1	Parte de la composición mínima de medios
Monobásico de fosfato potásico, grado ACS	VWR	BDH9268-500G	Parte de la composición mínima de medios
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	La cepa bacteriana de Pseudomonas aeurinosa PA01 con modificación GFP se utilizó para este estudio.
Cloruro de sodio, ACS	VWR	BDH9286-500G	Parte de la composición mínima de medios
Fosfato de sodio, monobásico, anhidro, grado reactivo	VWR	97061-942	Parte de la composición mínima de medios