Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes tumorales In vitro. La variabilidad en la apoptosis en el tejido tumoral se cuantificó utilizando tinciones fluorescentes y el coeficiente de difusión eficaz del fármaco quimioterapéutico doxorrubicina en el tejido tumoral se evaluó.
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Artículo de método
Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral
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Resumen
Resumen
Hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos que imita la entrega y el aclaramiento sistémico de fármacos para heterogéneos tejidos tridimensionales tumorales in vitro. Nutrientes suministrados por la vasculatura no llegan a todas las partes de los tumores, dando lugar a microambientes heterogéneo que consiste en tipos de células viables, quiescentes y necróticas. Muchos fármacos de cáncer no logran penetrar con eficacia y tratar todos los tipos de células, debido a esta heterogeneidad. Las monocapas de células de cáncer no imitan esta heterogeneidad, por lo que es difícil de probar fármacos contra el cáncer con un adecuado modelo in vitro. Nuestros dispositivos de microfluidos se fabricaron fuera de PDMS mediante litografía blanda. Esferoides multicelulares tumorales, formadas por el método de la gota colgante, se insertaron y constreñido en cámaras rectangulares en el dispositivo y se mantiene con perfusión del medio continuo en un lado. La forma rectangular de cámaras en el dispositivo creado gradientes lineales dentro del tejido. Manchas fluorescentes se utilizan para cuantificar ªe variabilidad en la apoptosis en el tejido. Los tumores en el dispositivo fueron tratados con el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina fluorescente, el tiempo transcurrido microscopía se utilizó para controlar su difusión en el tejido, y el coeficiente de difusión efectiva se estimó. El método de la gota colgante permite rápida formación de esferoides uniformes a partir de varias líneas celulares de cáncer. El dispositivo de activar el crecimiento de esferoides de hasta 3 días. Las células en la proximidad del medio que fluye fueron mínimamente apoptótica y los alejados del canal eran más apoptótica, con lo que precisa que imitan las regiones de los tumores adyacentes a los vasos sanguíneos. El valor estimado del coeficiente de difusión doxorrubicina mostró de acuerdo con un valor previamente en el cáncer de mama humano. Debido a que la penetración y la retención de las drogas en los tumores sólidos afecta a su eficacia, creemos que este dispositivo es una herramienta importante en la comprensión del comportamiento de los medicamentos y el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.
Protocolo
1. Fabricación de los dispositivos
La réplica de características de microfluidos en materiales elastoméricos se basó en el método descrito por Duffy et al. 1
- Elastómero Mix (polidimetilsiloxano; PDMS) y agente de curado del Kit de elastómero de silicona (Dow Corning, Midland, MI) en una proporción en peso 9:1 y se vierte sobre el maestro para formar una capa de 4 mm de espesor. Degas para eliminar burbujas de aire y curar la mezcla a 60 ° C durante 5 horas. Pelar PDMS curado del molde para obtener un sello de características de flujo en el elastómero.
- Haga agujeros para las entradas y salidas de 1,....
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Discusión
La vascularización de los tumores son escasas y mal desarrollados 7,8. Hay regiones situadas lejos (> 100 mm) de los vasos sanguíneos que son inaccesibles para los nutrientes y medicamentos suministrados aunque la vasculatura 9. El microambiente heterogénea resultante contribuye a la eficacia limitada de muchos agentes quimioterapéuticos 10. El dispositivo microfluídico desarrollado aquí recrea un microambiente tumoral heterogénea que se caracteriza por la proliferación, las células q.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención # 1R01CA120825-01A1, la investigación en colaboración Biomédica (CBR) Programa de la Universidad de Massachusetts Amherst, y la Beca J. Isenberg para Bhushan Toley. Agradecemos la valiosa contribución de James Schafer, el camarógrafo, narrador y editor de este video.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de reactivo | Empresa | El número de catálogo | Comentarios |
| Kit de silicona elastómero | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsia en sacabocados | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1,5 mm |
| PTFE tubería | Cole Parmer | EW-06.417-31 | 0,032 "ID |
| Hombre luer lock | Qosina | 65111 | |
| Púas conector hembra luer lock | Qosina | 11556 | |
| Válvula de cierre | Idex Salud y Ciencia | P-721 | |
| Y-conector | Idex Salud y Ciencia | P-513 | |
| 20G 1,5 "agujas | BD Bioscience | 305176 | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma | H-4034 | |
| CaspGLOW fluoresceína | Biovision | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision | K193-25 | |
| Clorhidrato de doxorubicina | Sigma | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Carcinoma de colon humano línea celular |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Carcinoma ductal Humanos línea celular |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Adenocarcinoma mamario humano línea celular |
Referencias
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K.
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Reimpresiones y permisos
