Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.
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Artículo de método
Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas
En este artículo
Resumen
Resumen
Investigación de la función mitocondrial representa un parámetro importante de la fisiología cardiaca como las mitocondrias están implicadas en el metabolismo energético, el estrés oxidativo, la apoptosis, el envejecimiento, encefalomiopatías mitocondrial y la toxicidad del fármaco. Teniendo en cuenta esto, las tecnologías para medir la función mitocondrial cardiaco están en demanda. Una técnica que emplea un enfoque integral para medir la función mitocondrial es respirométrica fosforilación oxidativa (OXPHOS) análisis.
El principio de la evaluación de la fosforilación oxidativa respirometría se centra en medir la concentración de oxígeno que utiliza un electrodo de Clark. A medida que el haz de fibras permeabilized consume el oxígeno, la concentración de oxígeno en la disminución de cámara cerrada. Utilizando sustrato seleccionado desacoplador inhibidor de los protocolos de valoración, los electrones se proporcionan a sitios específicos de la cadena de transporte de electrones, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial. Técnicas de preparación antes del análisis de respirometría de la función mitocondrial, mecánicos y químicos se utilizan para permeabilizar el sarcolema de las fibras musculares. Permeabilización química emplea saponina para perforar de forma selectiva la membrana celular, manteniendo la arquitectura celular.
Este documento describe minuciosamente los pasos a seguir en la preparación de saponina de piel fibras cardiacas para medir el consumo de oxígeno para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial. Además, la solución de problemas asesoramiento, así como sustratos específicos, los inhibidores y desacopladores de que se puede utilizar para determinar el funcionamiento de las mitocondrias en sitios específicos de la cadena de transporte electrónico se proporcionan. Es importante destacar que el protocolo descrito puede aplicarse fácilmente en el tejido cardíaco y esquelético de varios modelos animales y muestras humanas.
Protocolo
1. Preparación de los reactivos
- La solución de la relajación y la conservación (RP solución) se prepara como se describió anteriormente, con pequeñas modificaciones 1. En pocas palabras, la solución consiste en RP 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20 mM imidazol, ditiotreitol 0,5 mM, 20 mM de taurina, 50 mM K-MES, 6,56 MgCl 2, 5,7 mm ATP, fosfocreatina 14,3 mm, pH 7.1, ajustado a temperatura ambiente (TA). Filtrar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, para esterilizar. Divida en 15 porciones ml (Falcon tubos de polipropileno) y almacenar a -20 ° C Véase la discusión para las recetas.
- La solución de respirometría mitocondrial (MiR05) se prepara como se describió anteriormente 2 y contiene 0,5 mM EGTA, 3 mM de MgCl 2 .6 H 2 O, taurina 20 mM, 10 mM KH 2 PO 4, HEPES 20 mM, BSA 1 g / L, 60 mM de potasio lactobionato, 110 mm sacarosa, pH 7.1, ajustado a 30 ° C. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, para esterilizar. Se dividen en porciones de 50 ml (Falcon tubos de polipropileno) y almacenar a -20 ° C. Véase la discusión para las recetas. El factor de solubilidad del oxígeno para MiR05 a 30 ° C y 37 ° C es de 0,92 3.
2. Preparación del tejido
A. cardíaco fibras preparación mecánica
- Procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Calgary y Cuidado de Animales del Comité de Uso y cumplir con la Asociación Canadiense de directrices Laboratorio de Ciencias Animales de experimentación.
- La dislocación cervical para inmovilizar el ratón es el método preferido. Por otra parte, intraperotineal (IP) de inyección de ketamina y xilazina (80 y 10mg/kg, respectivamente) o 0.5mg/kg de pentobarbital de sodio puede ser administrado. Nota: El pentobarbital sódico es un inhibidor reversible de la NADH deshidrogenasa (complejo I) 4.
- Quitar el corazón y colocarlo en un plato de petri-que contiene la solución de RP en el hielo (Figura 1). Retire con cuidado el tejido conectivo y / o grasa usando un microscopio de disección.
- Cortar el corazón por la mitad a lo largo del tabique. Los impuestos especiales de 10 a 25mg de peso húmedo (ph) de los tejidos mediante la reducción de la superficie del endocardio del ventrículo izquierdo (fig. 1B). Asegúrese de que la incisión es a lo largo de la orientación de las fibras para minimizar el daño mecánico al miocardio.
- Coloque la disección, sub-muestra de tejido en un aparte-petri plato que contiene la solución de RP en el hielo. Utilizando un microscopio de disección cortar el corazón en tiras longitudinales a lo largo de orientación de las fibras con un diámetro de 1 a 1,5 mm.
- Acortar las tiras con un bisturí para longitudes de 2 a 4 mm (fig. 1C).
- Usando extremo cuidado y unas pinzas afiladas mecánicamente haces de fibras separadas. Paquetes de final de la fibra debe contener un máximo de 6-8 fibras, conectadas por pequeñas áreas de contacto, que no pesen más de 5 mg de peso húmedo. Fibras cardíacas de 1-3mg ww se recomiendan. Visualmente, el tejido cardiaco debe cambiar de color rojo original a un color rosa pálido (Figura 1D).
B. cardíaco preparación de fibras químicas paquetes
- Coloque una placa de 12 pozos en el hielo.
- Enjuague bien la (s) con la solución de RP para minimizar la contaminación de calcio 5.
- La transferencia de los haces de fibras mecánicamente preparado para un pozo que contiene 3 ml helada solución RP con 50ug / ml de saponina. Nota: La concentración de saponina no depende de la cantidad de músculo cardíaco presente en la solución.
- Incubar durante 20 minutos con agitación suave en el hielo.
C. fibra cardiaca paquete de lavado
- Enjuague un nuevo pozo con MiR05 para minimizar la contaminación de calcio 5.
- La transferencia de los paquetes cardiaca a los 10 ml que contiene nuevas y helada MiR05. Incubar durante 10 minutos con agitación suave en el hielo.
- Repetir (1-2) 2-3 veces con agua dulce MiR05. Los lavados repetitivos son para garantizar la eliminación o la saponina, ATP, ADP y los sustratos que queda de los haces de fibras.
D. determinación del peso húmedo
- Directamente antes del análisis de las vías respiratorias, peso húmedo se obtiene borrando los paquetes de fibras individuales (1-3mg húmedo) sobre una superficie absorbente (papel de filtro) el uso de fórceps y la celebración de la fibra a la superficie durante 5 segundos o hasta que toda la humedad se evacua.
- Utilizando otra superficie absorbente, eliminar el exceso de líquido de los fórceps.
- Tara la escala y el lugar del haz de fibras de un plástico pesan barco para la medición de la masa.
- Transferir el haz de fibras cardíacas de un nuevo pozo con helado de MiR05. El haz de fibras está listo para la evaluación del consumo de oxígeno.
3. Análisis de la fosforilación oxidativa respirometría
A. Equipo de respirometría
- El laboratorio utiliza y recomienda una titulación de dos cámaras de inyección oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). El Oxygraph 2-k ofrece respirometría de alta resolución en gran parte mediante la utilización de hardware y software instrumentales (DatLab) que minimiza el instrumental de fondo que contribuyen a laartefactos de consumo de oxígeno.
- La calibración del oxygraph es un paso esencial para minimizar los efectos de confusión de consumo de oxígeno instrumental. Calibración varía ligeramente en función del oxygraph. Consulte el manual de usuario oxygraph para procedimientos específicos.
B. Calidad de Representante de Control / técnicas de validación de Protocolo
- Garantizar MiR05 ha sido añadido a la vivienda oxygraph cámaras los sensores de oxígeno polarográfico (POS) y dar el tiempo suficiente para la saturación del aire y el equilibrio de la MiR05 a 37 ° C antes de poner las fibras cardíacas murino en las cámaras de oxygraph.
- Las muestras de fibras cardíacas se colocan en la agitada MiR05 de las cámaras de oxygraph. Nota: Asegúrese de remover las barras son PVDF o PEEK recubierto bares agitador (6 mm de diámetro).
- Usando una jeringa llena de oxígeno, aumenta la concentración de oxígeno de las cámaras de oxygraph a 250 550uM. Cabe señalar que la concentración de oxígeno es limitante para la preparación de fibras permeabilized en hasta 50% por encima de saturación del aire 6. Permitir 5-10min para la estabilización de la concentración de oxígeno.
- Utilizando una microjeringa Hamilton 25μL, añadir 10μL de glutamato 2M y 5μL de 800 mm de malato de obtener una concentración final de 10 mm y 2 mm, respectivamente. Estas titulaciones permiten la determinación de complejo basal que el apoyo respiratorio (estado 2, la ausencia de ADP). Flujo de oxígeno debería estabilizarse en aproximadamente 5 minutos de la titulación. La preparación adecuada debe proporcionar el estado muy reproducible 2 el consumo de oxígeno.
- Después de 2-5 minutos de consumo de oxígeno estable, añadir 20μL de ADP 500 mm para una concentración final de 5 mm (saturación), utilizando una microjeringa Hamilton 25μL, de máxima (estado 3) la respiración mitocondrial a través de complejos estudios de I. Pocos usan esta alta concentración de ADP, sin embargo, es importante tener en cuenta que más del 90% de saturación se alcanza sólo con concentraciones superiores a 5 mM 7.
- Después de 2-5 minutos de consumo de oxígeno estable, añadir 5μL de 4 mm de citocromo c para obtener una concentración final de 10μM, utilizando una microjeringa Hamilton 10μL, para el análisis de control de calidad de la membrana mitocondrial externa (OMM), la integridad.
- Después de 2-5 minutos de consumo de oxígeno estable, añadir 1μL de 4 mg / mL oligomicina, utilizando una microjeringa Hamilton 10μL, para inhibir la ATP sintasa. Este paso titulación ofrecerá validación de indemnidad de la membrana interna mitocondrial.
- Tras la evaluación de la fosforilación oxidativa respirometría. La muestra se mantiene el peso seco o determinación de los marcadores mitocondriales.
- Quitar MiR05 de las cámaras de vidrio de la oxygraph. Lave las cámaras de al menos tres veces con agua destilada (DDC 2 O).
- Lave las cámaras de al menos tres veces con 100% de etanol (EtOH) para eliminar EtOH solubles, tales como inhibidores de la oligomicina.
- Lave las cámaras con EtOH 70% tres veces con el final de EtOH 70% de lavado 30 minutos que dura para esterilizar las cámaras oxygraph.
- Antes de la adición de MiR05 para el nuevo protocolo de valoración experimental garantizar las cámaras que contienen los puntos de venta son lavados por lo menos cinco veces con ddH 2 O.
- Las valoraciones de validación se puede realizar como un protocolo individual (Figura 2) o titulaciones podrán ser incluidos en un protocolo de valoración bien planificada en función de los objetivos experimentales y de diagnóstico de los estudios de respirometría.
4. Los resultados representativos:
El consumo de oxígeno en las fibras cardiacas debidamente preparado murino es evaluado por el protocolo de control de calidad, como se muestra en la Figura 2. Figuras 3-5 proporcionan ejemplos comúnmente encontrados de forma incorrecta preparado fibras cardiacas. La relación del control respiratorio (RCR) representa un importante índice de respirometría. Este parámetro indica el acoplamiento entre el consumo de oxígeno y la fosforilación oxidativa. En las preparaciones de fibra permeabilized, el RCR es la tasa de respiración en el estado 3 en relación con el estado 2 o, alternativamente, el estado 3 en el estado 4 (inducido por oligomicina y / o atractilosida, ATR). Además, RCR puede ser utilizado como un marcador de garantía de calidad y pueden identificar cambios en el acoplamiento resultantes de las intervenciones experimentales o patológicas 5. Bien preparados junto permeabilized cardiaca murino producir un RCR entre 3-6 dependiendo de la solución de incubación utilizado 1, 8, 9.
La valoración del citocromo c se utiliza como una validación de la preparación del tejido apropiado. Citocromo c es una proteína ubicada en el espacio intermembrana de la membrana mitocondrial interna 10. Cuando la membrana externa de la mitocondria está intacto, el citocromo c endógena se mantiene en el espacio intermembrana y la valoración de los exógenos citocromo c tiene un efecto insignificante en la respiración (Figura 2). Si la membrana externa de la mitocondria está dañada, el endógeno citocromo c puede ser lanzado desde el espacio intermembrana e inhibe la respiración hasta exógena citocromoc Además (Figura 3). La preparación apropiada debe experimentar sólo una ligera elevación en el flujo de oxígeno al citocromo c Además en el rango de 5-15% 5. Además, esta titulación permite experimental para la evaluación de la influencia del estrés patológico o experimentales sobre intacta la membrana mitocondrial externa. Si un efecto de citocromo c se experimenta, garantizar la atención durante la preparación mecánica del tejido y / o reducir la concentración de saponina.
La adición de oligomicina y / o ATR se utiliza para evaluar las alteraciones en la respiración de fugas, consumo de oxígeno no contribuye a la fosforilación de ADP 11. Además, este paso de dosis puede ser utilizado como una validación de la preparación de la muestra adecuada. Las fibras de control o de tipo salvaje debe ser sensible a esta suma y la experiencia de una reducción significativa en el flujo de oxígeno. A RCR bajos y una menor sensibilidad a la oligomicina y / o ATR resultando en un flujo de oxígeno relativamente elevada indica un daño a la membrana mitocondrial interna durante la preparación (Figura 4). Es probable que el daño inducido durante la separación mecánica de las fibras cardíacas, como la membrana mitocondrial interna es menos susceptible a insultar por la saponina en relación a la membrana mitocondrial externa. Sin embargo, tanto la preparación mecánica y química puede tener que ser ajustada en consecuencia para evitar que las fibras cardiacas mal preparados 5, 12.
Los haces de fibras saponina de piel de los ratones no debe permanecer en la solución de RP por más de 6 horas o la solución MiR05 por más de 2 horas. La falta de respuesta a las titulaciones de sustrato-inhibidor desacoplador-como se ve en la Figura 5 puede ser indicativo de los períodos de incubación prolongados. Los esfuerzos posteriores deben reducir al mínimo los períodos entre el sacrificio de los animales y las mediciones de consumo de oxígeno.
Figura 1. La preparación mecánica de murino haces de fibras cardíacas. A. El corazón entero inmediatamente después de la disección. B. Una muestra de 10-25mg del ventrículo izquierdo anterior. C. tejido cardiaco dividido en 1 mm de diámetro y 2 a 4 mm tiras de longitud. D. final haces de fibras cardiacas listo para la permeabilización de la química con saponina.
Figura 2. Los resultados representativos de la preparación del tejido adecuada utilización de la evaluación polarográfico. El estado 2 flujo de oxígeno con el apoyo de glutamato complejo que los sustratos y malato (M / G) y se estimuló significativamente tras la adición de ADP (estado 3). No hay efecto estimulador de la exógena citocromo c indica además la membrana mitocondrial externa está intacta. Sensibilidad del consumo de oxígeno para oligomicina sugiere la integridad de la membrana interna mitocondrial está intacto. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP, el citocromo c, c cito; oligomicina, o.
Figura 3. Citocromo c efectos de validación de pruebas de evaluación de la utilización de polarográfico. El estado 2 flujo de oxígeno con el apoyo de glutamato complejo que los sustratos y malato (M / G) y se estimuló significativamente tras la adición de ADP (estado 3). Efecto estimulador de la exógena citocromo c indica además la integridad de la membrana externa mitocondrial se ve comprometida. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP, el citocromo c, cito c.
Figura 4. Interior integridad de la membrana mitocondrial prueba de validación de la utilización de la evaluación polarográfico. El estado 2 flujo de oxígeno con el apoyo de glutamato complejo que los sustratos y malato (M / G) y un estímulo relativamente débil del consumo de oxígeno después de la adición de ADP (estado 3). Falta de sensibilidad del consumo de oxígeno a oligomicina sugiere la membrana mitocondrial interna está dañada. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP oligomicina, o.
Figura 5. Polarográfica evaluación después de la incubación prolongado en MiR05. El consumo de oxígeno es insensible a la adición exógena de glutamato y malato (M / G) y el consumo de oxígeno después de la adición de ADP (Estado 3) se reduce. No hay efecto estimulador de la exógena citocromo c y la insensibilidad Además del consumo de oxígeno a oligomicina se experimenta. La falta de respuesta a las adiciones a la solución de incubación extramitocondrial sugiere estabilidad funcional mitocondrial se ve comprometida. La concentración de oxígeno en una cámara de 2 ml cerrado se identifica por la línea azul. El consumo de oxígeno de la muestra de tejido cardiaco en una cámara de 2 ml cerrado se representa por la línea roja. Malato y el glutamato, M / G, difosfato de adenosina, ADP, el citocromo c, cito c.
1. Notas: Preparación de los reactivos
Preparación de la solución de archivo K 2 100 mM EGTA
| Nombre del reactivo | La concentración final (mM) | g/100 ml H 2 O |
| Etilenglicol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) | 100 | 3.805 |
| Hidróxido de potasio (KOH) | 200 | 1.15 |
Nota: Ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente.
Preparación de Ca 2 Solución de archivo EGTA 100 mM
| Nombre del reactivo | La concentración final (mM) | g/100 ml H 2 O | Comentarios (opcional) |
| Etilenglicol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) | 100 | 3.805 | Calor a 80 ° C y mezclar suavemente. |
| De carbonato de calcio (CaCO3) | 100 | 1.001 | La concentración de calcio debe ser preciso como el calcio regula la función de varios orgánulos como las mitocondrias. Asegurar la solubilización completa de todos los CaCO 3. La solución final debe ser completamente transparente. CaCO 3 es inicialmente mezclado con EGTA y un poco de agua para activar la formación de ácido carbónico y la evaporación de CO 2. Esta reacción puede acelerarse por el calentamiento hasta 80 ° C. |
| Hidróxido de potasio (KOH) | 200 | 1.15 | Se neutraliza con KOH después de la evaporación de CO 2 se ha completado. |
Nota: Ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente.
Preparación de la relajación y la solución de preservación (Solución RP) 1
| Reactivo | La concentración final (mM) | Por litro | Comentarios |
| K 2 EGTA | 7.23 | 72.3 mL | |
| CAK 2 EGTA | 2.77 | 27.7 mL | |
| Imidazol | 20 | 1.36g | |
| Ditiotreitol | 0.5 | ||
| Taurina | 20 | 2.52g | |
| Adenosina 5'-trifosfato disódico sal hidratada (ATP) | 5.7 | 3,14 g | |
| La fosfocreatina (PCr) | 14.3 | 4.0g | |
| Cloruro de magnesio (MgCl 2) | 6.56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
Nota: Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente
Preparación de la solución respirometría mitocondrial (MiR05 solución) 2
| Reactivo | La concentración final (mM) | Por litro | Comentarios (opcional) |
| Etilenglicol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) | 0.5 | 0.190g | Se utiliza como un quelante de calcio |
| Magnesio hexahidrato de cloruro (MgCl 2 .6 H 2 O) | 3.0 | 0.610g | La calidad de la preparación de la fibra no se puede probar sin Mg 2 +. |
| Taurina | 20.0 | 2.502g | La taurina es un estabilizador de membrana y antioxidante. 20 mm es la concentración intracelular presente en el corazón. |
| Potasio fosfato monobásico (KH 2 PO 4) | 10.0 | 1.361g | |
| 20.0 | 4.77g | ||
| Potasio lactobionato | 60.0 | 120 ml de 0,5 M K-lactobionato valores | 0,5 M K-lactobionato: Añadir 35,83 g de ácido lactobiónico a 100 ml de H2O y el pH de 7,0 a temperatura ambiente. Ajuste el volumen a 200 ml con ddH 2 O. Se utiliza para reproducir la alta concentración intracelular de K +. Anteriormente KCl fue utilizado, sin embargo, el alto Cl-inhibe la función mitocondrial de creatina quinasa. |
| Sacarosa | 110.0 | 37.65g | Se utiliza como limpiador ROS. |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | 1 g / L | 1g | Se utiliza como estabilizador de la membrana, antioxidantes y quelantes de calcio y ácidos grasos libres. |
Nota: Ajustar el pH a 7.1 a 30 ° C
3. Notas: Análisis de la fosforilación oxidativa respirometría
B. Sustratos Select, desacoplantes y los inhibidores
Lista de los sustratos seleccionados para el análisis mitocondrial respirometría
| Sustrato | [Archivo] | Preparación | Volumen por 2 ml | [Final] | Comentarios |
| Adenosina 5'-difosfato monopotásico dihidrato de sal (ADP) | 500 mm | 246mg / ml ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -80 ° C en 250 alícuotas. | 20 ul | 5mM | Para mantener constante Mg 2 + + durante los experimentos de respirometría añadir 0,6 moles de MgCl 2 / ADP mol. |
| Ascorbato | 800 mm | 0.1584g / mL ddH 2 O. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 200 mL. Sensible a la luz | 5 l | 2 mM | Actúa como sustrato cuando se utiliza en paralelo con TMPD. Debe corregir para el flujo de oxígeno para la auto-oxidación. |
| Citocromo C | 4mM | 50 mg / mL ddH 2 O. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. | 5 l | 10um | |
| Carbonilo cianuro p-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) | 0.1 mM | 0.254mg/10 ml EtOH al 100%. Guarde en frascos de vidrio a -20 ° C en 500 alícuotas. | Pasos de 1 l | Actúa como un desacoplador. Determina la capacidad máxima de transporte de electrones y una limitación del transporte de electrones por el sistema de fosforilación. | |
| Glutamato | 2M | 0.3742g / mL ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. | 10ul | 10 mM | Actúa como un sustrato para la NADH deshidrogenasa (complejo I). |
| Malato | 800 mm | 0.1073g / mL ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. | 5UL | 2 mM | Actúa como un sustrato para la NADH deshidrogenasa (complejo I). No se puede apoyar la respiración solo. |
| Piruvato | 1M | 11mg/0.1 ml ddH 2 O. Prepare frescos. | 5 l | 2,5 mm | Actúa como un sustrato para la NADH deshidrogenasa (complejo I). |
| Succinato | 1000mm | 1.3505g / 5 ml ddH 2 O. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. | 20 ul | 10 mM | Actúa como sustrato de la succinato deshidrogenasa (complejo II). |
| N, N, N ', N'-tetrametil- pphenylenediamine Dihidrocloruro (TMPD) | 200 mM | 47.1mg / mL ddH 2 O. Añadir ascorbato 0,8 M a una concentración final de 10 mm para evitar la auto-oxidación Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 200 mL. | 5 l | 0,5 mM | Auto-oxidación de la solución madre evidente por la aparición de coloración azul. Actúa como sustrato cuando se utiliza en paralelo con TMPD. Debe corregir para el flujo de oxígeno para la auto-oxidación. |
Inhibidores de la lista de seleccionados para el análisis mitocondrial respirometría
| Sustrato | [Archivo] | Preparación | Volumen por 2 mL Cámara | [Final] | Comentarios |
| Antimicina | 5mM | 27.4mg/10 ml EtOH al 100%. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. | 1 l | 2.5μM | Inhibidor de la coenzima Q: citocromo c oxidorreductasa (complejo III) |
| Atractilosida | 50 mM | 40 mg / mL ddH 2 O. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. | 30 l | 0,75 mm | Inhibidor de la ATP sintasa. |
| Oligomicina | 4 mg / mL | 4 mg / mL de EtOH al 100%. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 200 mL. | 1 l | Inhibidor de la ATP sintasa. | |
| Cianuro de potasio | 1M | 65.1mg / mL ddH 2 O. Prepare frescos. Ajustar el pH a 7,1 a temperatura ambiente | 1 l | 1 mM | Inhibidor del citocromo c oxidasa (complejo IV). Utilizar TMPD siguientes y titulación para acceder a la auto-oxidación del ascorbato. |
| Rotenona | 0.1 mM | 0.39mg/10 ml EtOH al 100%. Almacenar a -20 ° C en 250 alícuotas. Sensible a la luz. | 1 l | 0.05μM | Inhibidor de la NADH deshidrogenasa (complejo I). Las concentraciones más altas puede ser necesario, sin embargo, para reducir la retención de la rotenona en la cámara comenzará como se indica. |
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Discusión
La técnica de saponina-permeabilized fibras cardiacas ofrece un compromiso único entre in vitro e in vivo en la evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial OXPHOS. Ventajas de esta técnica incluyen el aumento de relevancia fisiológica en comparación con las mitocondrias aisladas como la arquitectura celular se conserva. Mientras que la membrana plasmática se degrada, las estructuras intracelulares de membrana como la mitocondria 12, 14, 14 del retículo sarcoplásmico, miofilamentos y el ci...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Canadá Genoma. JS tiene premios salario apoyo de la Fundación del Patrimonio de Alberta para la Investigación Médica, Heart and Stroke Foundation de Canadá y la Asociación Canadiense de Diabetes. El laboratorio desea agradecer la asistencia técnica de los instrumentos de Oroboros durante la adquisición de la técnica de fibra de saponina-permeabilizadas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol al 100 % | Fisher Scientific | HC600 | |
| Etanol al 70% | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosina 5′sal monopotásica de difosfato dihidratada (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albúmina de suero bovino esencialmente libre de ácidos grasos–gratuito | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosina 5′-clorhidrato de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractilosido | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Carbonato de calcio | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cianuro p-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Etanolamina-bis-(2-amino–éter tilo)-N,N,N′,′ácido tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Ácido glutámico | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamina | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Ácido lactobiónico | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Ácido málico | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,’Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Fosfocreatina | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Hidróxido de potasio | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Cianuro de potasio | Fluka | 60178 | |
| Fosfato monobásico de potasio | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenona | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Pentobarbital sódico | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54,7 mg/ml |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Ácido succínico | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xilacina | Bayer AG | Rompun | |
| ddH₂O2O | |||
| Hielo | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| Tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml | VWR international | 89004-368 | |
| Tubos cónicos de centrífuga de 50 ml de polipropileno | VWR international | 89004-364 | |
| Pinzas rectas para joyeros | George Tiemann &y Cía. | 160-50B | |
| Pinzas de joyero curvas | George Tiemann &y Cía. | 160-57B | |
| Tijeras quirúrgicas rectas | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Hoja de bisturí estéril | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Filtros para jeringa | VWR international | CA28145-485 | |
| medidor de pH | VWR international | CA11388-308 | |
| Placas de Petri de vidrio | VWR international | 89000-300 | |
| Placas de cultivo celular de poliestireno de 12 pocillos | VWR international | 82050-926 | |
| Placa agitadora | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Báscula | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Microjeringa | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Microjeringa | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μjeringa microscópica l Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Botellas exprimibles Nalgene | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Platos pesadores de poliestireno | VWR international | 89106-750 | |
| Microscopio de disección | Olympus Corporation |
Referencias
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
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