Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Resumen

El ensayo describe un método rápido para medir la formación de biopelículas a principios de bacterias y hongos. Este método utiliza una placa de microtitulación como sustrato para la formación de biopelículas microbianas, y el biofilm se visualiza utilizando la cepa de cristal violeta. El ensayo ofrece ya sea un ensayo cualitativo o cuantitativo de la formación de biofilm temprano.

Resumen

Los biofilms son comunidades de microorganismos adheridos a las superficies, que se puede encontrar en los centros médicos, industriales y naturales. De hecho, la vida en una biopelícula probablemente representa el modo predominante de crecimiento de los microbios en la mayoría de entornos. Biofilms maduros tienen algunas características distintas. Microbios biofilm son típicamente rodeados por una matriz extracelular que proporciona la estructura y la protección a la comunidad. Los microbios que crecen en un biofilm también tienen una arquitectura característica generalmente compuesto por macrocolonies (que contiene miles de células), rodeada de canales llenos de líquido. Biofilm crecido microbios también son conocidos por su resistencia a una amplia gama de agentes antimicrobianos, como los antibióticos clínicamente relevantes.

El ensayo de placa de microtitulación es una herramienta importante para el estudio de las primeras etapas de formación del biofilm, y se ha aplicado principalmente para el estudio de las biopelículas bacterianas, aunque este ensayo también se ha utilizado para estudiar la formación de biopelículas fúngicas. Debido a que esta prueba se utiliza estática, el crecimiento de lotes condiciones, que no permite la formación de las biopelículas maduras típicamente asociados con los sistemas de celda de flujo. Sin embargo, el ensayo ha sido eficaz en la identificación de muchos factores necesarios para el inicio de la formación del biofilm (es decir, los flagelos, pili, adhesinas, enzimas que participan en cíclica-di-GMP vinculante y el metabolismo) y así como los genes implicados en la producción de polisacáridos extracelulares. Además, los trabajos publicados indican que los biofilms cultivadas en placas de microtitulación se desarrollan algunas de las propiedades de los biofilms maduros, con una tolerancia de antibióticos y la resistencia a los efectores del sistema inmune.

Este ensayo de microtitulación plato sencillo permite la formación de un biofilm en la pared y / o fondo de un plato de microtitulación. La naturaleza de alto rendimiento de la prueba lo hace útil para las pantallas de genética, así como la formación de biofilm por pruebas de múltiples cepas en condiciones de crecimiento diferentes. Las variantes de este ensayo se han utilizado para evaluar la formación de biofilm principios para una amplia variedad de microbios, incluyendo pero no limitado a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococos, micobacterias y hongos.

En el protocolo descrito aquí, nos centraremos en el uso de este ensayo para estudiar la formación de biofilm por el organismo Pseudomonas aeruginosa modelo. En este ensayo, la extensión de la formación de biopelículas se mide utilizando el colorante cristal violeta (CV). Sin embargo, una serie de manchas de colorimetría y metabólicas se han reportado para la cuantificación de la formación de biopelículas utilizando el ensayo de placa de microtitulación. La facilidad, bajo coste y la flexibilidad del ensayo de placa de microtitulación se ha convertido en una herramienta fundamental para el estudio de las biopelículas.

Protocolo

1. El crecimiento de un biofilm

1. Cultivar una cultura de la de tipo salvaje aeruginosa Pseudomonas o cepa mutante durante la noche en un medio rico (LB es decir)
2. Diluir el 1:100 noche sobre la cultura en un nuevo medio para los ensayos de biofilm. Un biofilm estándar medio de cultivo de P. aeruginosa es M63 medio mínimo suplementado con sulfato de magnesio, la glucosa y los ácidos casamino (véase el cuadro). Como un biofilm, la promoción de alternativas de medio que estimula el menor crecimiento del plancton y biofilms más robusta, la glucosa y los ácidos casamino puede ser sustituida por arginina como el carbón y la única fuente....

Discusión

Este método puede ser modificado para su uso con una amplia variedad de especies microbianas. Microbios móviles suelen adherirse a las paredes y / o en el fondo de los pozos, mientras que los no-móviles microbios normalmente se adhieren al fondo de los pozos. Las condiciones óptimas para la formación de biofilm (es decir, el medio de cultivo, temperatura, tiempo de incubación) debe ser determinada empíricamente para cada microbio. Recomiendo la realización de múltiples repeticiones para cada cepa o condición (4-8), y qu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 X M63			Preparar como un stock 5X M63 disolviendo 15 g de KH2PO4, 35 g K2HPO4 y 10 g de (NH4)2SO4 en 1 L de agua. Esta solución stock d–no necesita ser autoclavado y puede almacenarse a temperatura ambiente. Diluya el stock 5X en una proporción de 1:5, autóclavelo, enfríe y luego agregue los componentes deseados.
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A5132
sulfato de magnesio	Fisher Scientific	M63-500	Añadir hasta una concentración final de 1 mM. Preparar como solución madre de 1 M en agua y autoclavar.
Glucosa	Fisher Scientific	D16-3	Añadir hasta una concentración final del 0,2%. Preparar como solución madre al 20% en agua y autoclavar.
Casaminoácidos	BD Biosciences	223050	Añadir hasta una concentración final del 0,5%. Preparar como solución madre al 20% en agua y autoclavar.
Arginina	Sigma-Aldrich	A5131	Añadir hasta una concentración final de 0,4 %. Preparar como una solución madre al 20 % en agua y esterilizar por filtración. Esta fuente alternativa de carbono/energía puede reemplazar a la glucosa y a los ácidos casamino
Placas de microtitulación	BD Biosciences	353911	Placas de ensayo flexibles Falcon 3911, Microtest III, 96 pocillos, fondo en U, no estériles, no tratadas para cultivo de tejidos.
Tapas para placas de microtitulación	BD Biosciences	353913	Las tapas pueden reutilizarse limpiándolas con etanol al 95 % en agua.
violeta de cristal	Sigma-Aldrich	229641000	Preparar como una solución al 0,1 % en agua.