Evaluación del papel de la inmunidad del huésped en la infección por micobacterias utilizando un modelo de pez cebra

Resumen

Fuente: Luukinen, H., et al. Modelado de la tuberculosis en peces cebra adultos infectados por Mycobacterium marinum . J. Vis. Exp. (2018).

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Infección experimental por M. marinum con inyección intraperitoneal

1. Pipete una gota de 5 μL de la solución bacteriana diluida sobre un trozo de película parafilm y tira de la gota hacia una aguja de insulina de 30 G.
2. Utiliza peces salvajes de 5–8 meses y peces mutantes rag1−/−hu1999 para el experimento. Anestesiar a los peces cebra adultos en el acuario con éster etílico de ácido 3-aminobenzoico al 0,02% (pH 7,0). Coloca el pez con el lado ventral hacia arriba en una ranura sobre un plástico espumado y húmedo.
   NOTA: Los peces mutantes rag-/- no pueden someterse a la recombinación somática ni producir células T y B funcionales.
3. Inyecta la aguja entre las aletas pélvicas en un ángulo aproximado de 45°. Mantén la aguja abierta hacia arriba para comprobar que toda la abertura está dentro de la cavidad abdominal. Inyecta lentamente la suspensión bacteriana y retira la aguja con cuidado.
   NOTA: En caso de que el trazador rojo se esté filtrando del pez al inyectarlo, excluye al pez del experimento.
4. Inmediatamente después de la inyección, transfiere el pez a un acuario de recuperación con agua fresca.
5. Toma muestras de la suspensión bacteriana en placas 7H10 cada 15 minutos de la alitera bacteriana en uso e incuba la bacteria a 29 °C durante 5 días, verificando la dosis de infección contando las colonias en las placas.
6. Revisa regularmente el bienestar de los peces y eutanasia a cualquier pez con síntomas de infección con una concentración superior al 0,02% de éster etilílico de ácido 3-aminobenzoico (pH 7.0).
   NOTA: Aproximadamente el 7% de los adultos de pez cebra infectados con 34 ± 15 CFU y el 30% de los peces cebra infectados con 2029 ± 709 CFU habrán presentado síntomas a las 8 semanas19. Los síntomas pueden incluir natación anormal, falta de respuesta al tacto, jadeos, edema o efemismo observable.
7. Mantener al pez cebra según los estándares comunes

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mycobacterium marinum	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 927
Agar Middlebrock 7H10	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Enriquecimiento OADC de Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 medio	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Enriquecimiento del ADC de Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Tabletas salinas tamponadas con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Rojo fenol	Sigma-Aldrich	P3532
Aguja de 27 G	Henke Sass Lobo	4710004020
Jeringuilla de 1 mL	Henke Sass Lobo	4010.200V0
Aguja de insulina Omnican 100 30 G	Braun	9151133
Éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	A5040