Modelo in vitro de flujo paralelo de placas para estudiar la adhesión bacteriana en una biopsia tisular

Resumen

Fuente: Ditkowski, B., et al. Un modelo in vitro de un sistema de perfusión de placas paralelas para estudiar la adherencia bacteriana a tejidos de injerto. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demuestra el método de utilizar una cámara de flujo de placas paralelas para perfundir bacterias marcadas con fluorescencia sobre tejidos de injertos vasculares, permitiendo un análisis controlado de la adhesión bacteriana y la patogénesis temprana bajo condiciones de flujo cortante.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.1. Experimentos de perfusión in vitro utilizando una cámara de flujo de placas paralelas

1. Montar biopsias de tejido de 10 mm de diámetro y el mismo grosor en un sistema de cámara de flujo con la superficie interna orientada hacia arriba para entrar en contacto con la suspensión bacteriana.
   NOTA: El mismo grosor de tejido en varios injertos asegura que se alcance la misma altura tisular en el canal, permitiendo el flujo laminar en todas las condiciones. Todos los elementos de la cámara de flujo se presentan y describen en la Figura 1.
   1. Para comenzar el protocolo, coloca la pieza redonda de tejido entre una lámina de microscopio con perforación circular de 8 mm y una junta de goma.
      NOTA: El portaobjetos del microscopio posee una película inferior ultrafina que permite la generación del orificio de 8 mm. Junto con la lámina de goma, fija el tejido para permitir el contacto directo entre la muestra y el medio fluido y también evita la dislocación de la biopsia durante el experimento. La superficie del tejido investigado, que está expuesta al flujo (diámetro menor), no puede ser manipulada por las pinzas.
      1. Inserta el soporte con el papel en la lámina de junta que está incrustada en el marco metálico inferior de la cámara.
      2. Fija el marco metálico superior con la lámina de junta correspondiente en la parte inferior de la cámara con el soporte de pañuelo previamente insertado. Posteriormente, monta toda la cámara con ocho tornillos y tuercas. Asegúrate de que la altura de la cámara sea siempre la misma entre los injertos.
         NOTA: La altura de la cámara debe determinarse siempre al apretar los tornillos. Usa un calibre o una regla.
2. Conecta la cámara de flujo con una bomba peristáltica y el depósito de fluido con los tubos.
3. Perfundir los tejidos con suspensiones de 10^UFC /mL (verificados por conteo de unidades formadoras de colonias (CFU) y relacionados con mediciones OD₆₀₀ (densidad óptica)) en PBS (solución salina tamponada con fosfato) con un esfuerzo cortante de 3 dyne/cm² (dyne por unidad de presión centímetro cuadrado) mediante la bomba peristáltica (caudal 4 mL/min) durante 1 hora utilizando un reservorio bacteriano de 400 mL (diseño interno, Figura 1) acondicionado a 37 °C usando un termostato de placa (Tabla de Materiales).
4. Recircula continuamente la suspensión bacteriana de 100 mL usando el mismo depósito de recogida.
5. Tras la perfusión, desmonta la cámara para liberar el injerto y lava la pieza de tejido dos veces con 4 mL de PBS en una placa de 12 pozos usando el agitador orbital de laboratorio durante 3 minutos cada uno. Posteriormente, corta la parte interna del injerto usando un punzón de biopsia cutánea de menor diámetro.
6. Coloque cada biopsia tisular en un tubo separado de 14 mL que contiene 1 mL de NaCl estéril al 0,9%. Etiqueta el tubo como #1.
7. Desacopla las bacterias del tejido usando un baño de sonicación durante 10 minutos (amplitud = 100% y frecuencia = 45 kHz).
   NOTA: El desprendimiento total de bacterias de los injertos de tejido debe evaluarse tras la incubación de los parches durante la noche a 37 °C en un medio líquido TSB (caldo de soja tríptico), seguido de mediciones de_{OD 600} en comparación con parches de control tratados con una solución libre de bacterias.

Resultados

Figura 1: Imagen de un sistema de cámara de flujo recién desarrollado (diseño interno). A. El conjunto de flujo montado en la cámara de flujo (1) de dimensiones LxAncho x Altura: 125 mm x 55 mm x 18 mm (los tornillos combinados con tuercas ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Parche pericardio bovino (BP), pericardio peri-guardia flexible	Innovaciones Quirúrgicas Synovis, EE. UU.	PC-0404SN
Conductos de vena yugular bovina (BJV)	conducto Contegra; Medtronic Inc, EE. UU.	M333105D001
Homoinjerto criopreservado CH	Banco Europeo de Homoinjerto (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, EE. UU.	P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
Albúmina humana	Flexbumin; Baxter, Bélgica	BE171464LOT:16G12C
Caldo de soja tríptico (TSB)	Fluka, Steinheim, Alemania	22092-500G
Caldo de infusión para el corazón (BHI)	Fluka	53286-500G
Solución salina tamponada con fosfato (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Éster de N-hidroxisuccinimida (CF) de carboxifluoresceína	Sigma-Aldrich, Alemania	21878-100MG-F
Bomba peristáltica (MODELO ISM444B)	Estándar Ismatec BVP-Z; Cole Parmer, Wertheim, Alemania	631942-2
Baño de sonicación	Limpiador ultrasónico VWR; VWR, Radnor, Pa	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
Montaje antifade de oro ProLong	Invitrogen por ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF - agua ultrapura - H2O MilliQ	Millipore	87206462
Portaobjetos microscópicos - Cámaras de cultivo de tejidos (1 pozo)	Sarstedt	94.6140.102
1-pozo en Lumox desmontable	Sarstedt	94.6150.101
Acero inoxidable - cuchillas quirúrgicas	Swann-Morton	311
Tubo de silicona Tygon, diámetro de 1/8" x diámetro de 1/4"	Cole-Parmer	EW-95702-06	Rango de temperatura: –80 a 200°C Terilizar: Con óxido de etileno, irradiación gamma o autoclave durante 30 minutos, 15 psi de presión
Tubería BPT PharMed	Saint-Gobain	AY242012	Autoclavable 30 min a 121°C
Tubería Tygon LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Termostato	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz