Artículo de método

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

DOI:

10.3791/2457

11 de enero de 2011

En este artículo

Resumen

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Este protocolo de vídeo se muestra la aplicación de la prueba neuroesfera para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales de las eminencias ganglionares del día embrionario 14 de cerebro de ratón.

Resumen

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En los mamíferos, las células madre actúa como una fuente de células indiferenciadas para mantener génesis y renovación celular en diferentes tejidos y órganos durante el ciclo de vida del animal. Que potencialmente pueden reemplazar las células que se pierden en el proceso de envejecimiento o en el proceso de lesiones y enfermedades. La existencia de células madre neurales (NSC) fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss (1992) en los mamíferos adultos del sistema nervioso central (SNC) utilizando un nuevo sistema de suero libre de la cultura, el ensayo neuroesfera (NSA). El uso de este ensayo, también es posible aislar y expandir NSCs de diferentes regiones del sistema nervioso central embrionario. Estos in vitro NSCs ampliado son multipotentes y pueden dar lugar a los tres principales tipos de células del sistema nervioso central. Mientras que la NSA parece relativamente simple de realizar, la atención a los procedimientos demostrado aquí se requiere a fin de lograr resultados confiables y consistentes. Este video demuestra prácticamente la NSA para generar y ampliar NSCs a partir del día 14 embrionario del ratón tejido cerebral y ofrece detalles técnicos por lo que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la recolección de embriones de ratón E14, microdisección del cerebro para recoger las eminencias ganglionares, la disociación de los tejidos recolectados en el medio de NSC para obtener una suspensión de células individuales, y, finalmente, placas células en cultivo NSA. Después de 5-7 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes se pasan a ampliar aún más el número de la NSCs para futuros experimentos.

Protocolo

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1. Configuración básica antes de proceder a la disección:

  1. Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente.
  2. El medio es calentado en un baño de agua a 37 ° C.
  3. Frío HEPES buffer medio esencial mínimo (HEM), con alta concentración de antibióticos (10%) se prepara para la disección y el propósito de lavado. Por otra parte, NSC medio basal con la suplementación de los antibióticos también pueden ser utilizados para este propósito.
  4. 25-30 ml de HEM resfriado que contienen antibióticos se distribuye en tubos de 50....

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Discusión

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El ensayo neuroesfera es el método de elección para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales 1-5 debido a su sencillez y reproducibilidad. Este ensayo es una herramienta invaluable para generación a gran escala de células precursoras indiferenciadas del SNC, que podrían ser utilizados para los estudios in vitro e in vivo. Cabe destacar que neuroesferas podrían ser generados por la bona fide las células madre neuronales y progenitores más restringido. Por lo tanto,.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.

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Materiales

* Para hacer HEM, mezcla 110L paquete de MEM and160ml de HEPES 1M y obtener un volumen de 8,75 L con agua destilada. Ajuste el pH final de 7,4 y almacenar a 4 ° C.

Referencias

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  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mamm....

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