Evaluación de la inhibición de la propagación viral mediante el silenciamiento del genoma mediado por mímicos de microARN

Resumen

Fuente: Ruiz, A. J. y Russell, S. J. Regulación basada en microARN del tropismo del picornavirus. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el uso de análogos sintéticos de microARN para inhibir selectivamente la replicación viral en células epiteliales cultivadas. Destaca cómo el silenciamiento del genoma dirigido por microARN puede bloquear la diseminación del virus y confirmar la especificidad del direccionamiento mediante análisis de infectividad posterior.

Protocolo

1. Evaluación de la especificidad del microARN dirigido: ensayo de diseminación viral utilizando análogos sintéticos de microARN

NOTA: Se utiliza un mimético de microARN sintético para demostrar la especificidad de la interacción entre microARN y el blanco del microARN.

1. Incluya controles de transfección simulada, mimético de microARN de control negativo y solo mimético de microARN experimental para cada ensayo, con el fin de evaluar la toxicidad mediada por microARN. También es recomendable incluir un control positivo (es decir, un gen o genoma diana del microARN) ya que una baja eficiencia de transfección de los miméticos de microARN puede dar lugar a falsos negativos.
2. Siembre células H1-HeLa en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de manera que alcancen una confluencia del 80-90 % en el momento de la transfección (24 h posteriores a la siembra). Siembre las células en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10 % de suero bovino fetal, a 0,1 mL por pocillo.
   NOTA: Realice este ensayo en células permisivas para la replicación viral que no expresen los microARNs cognatos.
3. Caliente los reactivos de transfección a temperatura ambiente. Combine 9 µL de medio sin suero, 200 nM de concentración final por pocillo del stock del mimético de microARN, 0,18 µL de reactivo potenciador, 0,18 µL de reactivo de transfección y mezcle. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 2-5 min.
   NOTA: Los volúmenes indicados corresponden por pocillo. Se recomienda preparar una mezcla maestra para la transfección de todos los pocillos con el fin de mantener la consistencia y minimizar errores de pipeteo. La concentración óptima del mimético de microARN variará. Consulte las instrucciones del fabricante que acompañan al mimético de microARN para obtener una concentración inicial razonable. Esta generalmente oscilará entre 5 y 200 nM de concentraciones finales.
4. Aspire el medio de los pocillos y añada 92 µL de medio completo fresco.
   NOTA: Si hay un número considerable de muestras, realice este paso antes de preparar la solución de transfección y guarde la placa a 37 °C hasta que esté lista.
5. Añada toda la mezcla de transfección a las células gota a gota.
6. Incube a 37 °C durante 6 h.
7. Infecte cada pocillo a una baja MOI (multiplicidad de infección) para asegurar que un bajo porcentaje de células se infecte, permitiendo así el análisis de la diseminación del virus. Este protocolo utiliza una MOI de 0,2.
   1. Diluya los stocks de virus en medio sin suero hasta una concentración de MOI = 0,2 por 100 µL. Retire el medio de los pocillos y añada 100 µL de la dilución viral por pocillo.
   2. Incube a 37 °C durante 2 h.
8. Aspire el medio de cada pocillo y añada 100 µL de medio completo fresco.
9. Incube a 37 °C durante 20-22 h.
10. Determine la titulación del virus en los sobrenadantes.
    1. Recoja el sobrenadante de cada pocillo y sustitúyalo con 100 µL de medio completo fresco.
       NOTA: Si utiliza células en suspensión, re suspenda el botón celular del siguiente paso en 100 µL de medio completo fresco y devuélvalo al pocillo de la muestra para el ensayo de viabilidad.
    2. Elimine los restos celulares de los sobrenadantes recolectados mediante centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo y titule el virus infeccioso en células permisivas que no expresen los microARNs cognatos. 
       NOTA: Mantenga todas las muestras en hielo para evitar la pérdida de infectividad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua libre de nucleasas	Fisher Scientific	AM9938
Reactivo de transfección TransIT-2020	Mirus	MIR 5404
Reactivo de transfección TransIT-mRNA	Mirus	MIR 2225
Tubos de 2 mL con tapón roscado	Sarstedt	72.694.005
Miméticos de microARN	Dharmacon	Varied
Ensayo de proliferación celular MTT	ATCC	30-1010K