Generación de un virus del sarampión recombinante que codifica una proteína inmunoestimuladora

Resumen

Fuente: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramixovirus para la inmunomodulación dirigida a tumores: diseño y evaluación ex vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la generación de virus del sarampión recombinantes utilizando liposomas para entregar plásmidos que codifican el antigenoma viral y proteínas auxiliares esenciales en células productoras. El ARN transcrito y replicado conduce a la formación de partículas virales que expresan proteínas inmunomoduladoras y proteínas reporteras fluorescentes. Luego, se utiliza microscopía de fluorescencia para visualizar la formación de sincitios, confirmando la producción exitosa del virus recombinante.

Protocolo

NOTA: [O], [P] y [M] indican subsecciones aplicables a: virus oncolíticos (VO) en general, (la mayoría de los) paramixovirus o al virus del sarampión (VS) únicamente, respectivamente. [B] indica secciones específicas para transgenes de unidores bispecíficos de células T (BTE).

1 Clonación de transgenes que codifican inmunomoduladores en vectores de virus del sarampión

1. [O] Diseñar la secuencia del inserto.
   1. [O] Seleccionar un inmunomodulador de interés basándose en investigaciones bibliográficas o en datos exploratorios como pantallas genéticas, y obtener la secuencia de ADN complementario (cADN) correspondiente a partir de bases de datos apropiadas, tales como GenBank, el Archivo Europeo de Nucleótidos o el sistema internacional de información ImMunoGeneTics (IMGT).
   2. [O] Añadir características adicionales a la secuencia del transgén (Figura 1). Una secuencia Kozak previa y la optimización de codones específica de la especie pueden mejorar la expresión. Se requieren secuencias señal para la secreción. Incluir secuencias que codifiquen etiquetas proteicas N-terminal y/o C-terminal para detección y purificación. Incluir sitios de restricción para la inserción en el vector.
      NOTA: [M] Se necesitan unidades adicionales de transcripción (ATU) que contengan las señales de inicio y terminación del gen de la polimerasa del MV para la expresión del transgén a partir de genomas recombinantes de MV. Anteriormente se han desarrollado vectores adecuados de cADN anti-genómico, controlados por promotores del citomegalovirus (CMV) y que contienen ATU con sitios de restricción únicos para la introducción de transgenes de sentido positivo en posiciones definidas. [P] La colocación adecuada del transgén es crucial, ya que afecta la replicación viral y la expresión del transgén debido al gradiente de expresión típico de los paramixovirus. La introducción en una ATU cercana al extremo 3' del anti-genoma (es decir, en la posición líder o aguas abajo del gen P) generalmente produce una alta expresión del transgén a costa de una replicación viral reducida. Se puede esperar una mayor replicación y niveles más bajos de expresión del transgén al utilizar la ATU aguas abajo del gen H. El empaquetamiento del genoma de varios paramixovirus, incluido el virus del sarampión, requiere la unión de seis nucleótidos por cada proteína nucleocápside. Para la inserción de transgenes en estos virus, asegurarse de que el número total de nucleótidos del genoma completo sea divisible por seis. Esto se conoce como la "regla del seis". Si es necesario, incluir nucleótidos adicionales en el inserto (aguas arriba de la secuencia Kozak o aguas abajo del codón de parada) sin introducir desplazamientos del marco de lectura ni codones de parada prematuros. [M] Evitar secuencias particulares en el transgén que sean similares a las señales de inicio (AGGRNCMARGW) y terminación (RTTAWANAAAA) del gen del MV y a las secuencias de edición de ARN (AAAAAGGG).
   3. [O] Adquirir oligonucleótidos con la secuencia deseada o ensamblarlos a partir de secuencias disponibles mediante técnicas estándar de clonación molecular.
      NOTA: [O] Para la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del transgén, diseñar un cebador directo que incluya el sitio de restricción aguas arriba y los primeros 15-20 nucleótidos del inserto, y un cebador inverso que incluya los últimos 15-20 nucleótidos del inserto seguidos del sitio de restricción aguas abajo.
2. [O] Clonar el inserto en el ADN que codifica el (anti-)genoma viral.
   1. [O] Clonar el inserto en vectores de ADN o anti-genomas de virus de ARN mediante técnicas estándar de clonación molecular (es decir, restricción enzimática seguida de ligación de ADN).
      1. [O] Evitar la religación del vector utilizando sitios de restricción no compatibles o mediante desfosforilación previa a la ligación.
      2. [O] Aislar el producto de ligación mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior purificación del gel utilizando kits comercialmente disponibles. En general, se logra una eficiencia óptima de ligación con una relación molar de 3:1 de inserto respecto al vector.
   2. [O] Transformar el producto de ligación en bacterias competentes adecuadas para la recuperación eficiente de plásmidos grandes (es decir, realizar choque térmico en E. coli) e identificar clones bacterianos que contengan el ADN correcto mediante PCR de colonias.
   3. [O] Aislar el ADN amplificado de un único clon bacteriano utilizando kits comerciales de preparación de ADN. Confirmar la integridad genómica mediante digestión de control con enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo, HindIII para genomas de MV [M]). Confirmar la inserción correcta y la integridad del transgén mediante secuenciación.
      NOTA: [M] Para transgenes insertados en la ATU-H del MV, realizar secuenciación Sanger con los siguientes cebadores: H-9018 [cebador directo, se une a la posición 9018 del genoma del MV en el marco de lectura abierto (ORF) del gen H]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (cebador inverso, se une a la posición 9249 del genoma del MV en el ORF del gen L): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. Recuperación de partículas de virus del sarampión recombinantes que codifican inmunomoduladores

1. [O] Genere partículas de virus recombinantes a partir de ADN (anti-)genómico mediante la transfección de células productoras de virus según el protocolo estándar para el virus respectivo. Siga las pautas para trabajar bajo condiciones estériles. Realice el cultivo celular en campanas, en particular todos los pasos que involucren virus en cabinas de seguridad biológica de clase II.
   1. [M] Para el aislamiento de virus de sarampión a partir de ADNc, siembre células productoras de MV (células Vero derivadas de riñón de mono verde africano) de manera uniforme en una placa de 6 pocillos 24 h antes de la transfección. Siembre 2 x 10⁵ células en 2 mL de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) por pocillo para alcanzar una confluencia del 65–75% en el momento de la transfección.
      NOTA: [P] Reduzca el número de células si estas sobrepasaran antes de la formación de sincitios inducida por el virus.
   2. [P] Transfecte las células con ADN que codifique el antígenoma viral, plásmidos auxiliares requeridos y, si se desea, un plásmido que codifique un reportero fluorescente para evaluar la eficiencia de transfección.
      1. [M] Mezcle 5 µg de ADN recombinante que codifique el antígenoma del virus del sarampión, 500 ng de cada uno de los plásmidos de expresión mamífera que codifiquen las proteínas N y L del virus del sarampión, y 100 ng de cada uno de los plásmidos que codifiquen la proteína P en un volumen total de 200 µL de DMEM. Si se desea evaluar la eficiencia de transfección (y si no está ya presente en el constructo del antígenoma viral), incluya 100 ng de un plásmido de reportero fluorescente.
      2. Añada 18,6 µL de reactivo de transfección liposomal, mezcle inmediatamente agitando suavemente el tubo y incube durante 25 min a temperatura ambiente (RT).
      3. [P] Reemplace el medio con 1,8 mL de DMEM, 2% FBS, 50 µg/mL de kanamicina (u otro antibiótico para prevenir contaminación) por pocillo, luego añada la mezcla de transfección gota a gota al pocillo y agite suavemente. Incube las células durante la noche a 37 °C, 5% CO₂. Al día siguiente, reemplace el medio con 2 mL de DMEM fresco, 2% FBS y 50 µg/mL de kanamicina; repita este paso cuando el medio se vuelva ácido.
         PRECAUCIÓN: [O] Manipule las células y materiales de acuerdo con las regulaciones de seguridad biológica, ya que el virus puede estar presente desde la transfección hasta los pasos siguientes. Deseche los residuos (potencialmente) infecciosos de manera adecuada.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del genoma de un virus del sarampión. La proteína verde fluorescente mejorada (eGFP) está codificada en una unidad de transcripción adicional ubicada aguas abajo de la secuencia líder (ld). N, P, M, F, H y L designan genes que codifican las proteínas estructurales del virus del sarampión: nucleoproteína, proteína P, proteína matriz, proteína de fusión, proteína hemaglutinina y proteína grande (polimerasa), respectivamente, cuya expresión diferencial se visualiza arriba. Un transgén de un enlazador bispecífico de células T (BTE) se inserta en una unidad de transcripción adicional (ATU) aguas abajo del marco de lectura abierto H. El transgén codifica un péptido señal de inmunoglobulina kappa (Igκ) para una secreción eficiente, así como etiquetas proteicas de hemaglutinina de influenza (HA) y hexa-histidina (His) para detección y purificación. Los genes que codifican los dominios variables de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) de anticuerpos dirigidos contra CD3 y CD20, respectivamente, están conectados mediante secuencias de enlazadores peptídicos que contienen residuos de glicina (G) y serina (S). La secuencia del transgén va precedida por una secuencia de Kozak. Aguas abajo de la región codificante, se han incluido nucleótidos adicionales como ejemplo para cumplir con la regla del seis. El casete de inserción está flanqueado por dos sitios de restricción que permiten su inserción en la ATU correspondiente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de desfosforilación y ligación rápida de ADN	Roche Life Science, Mannheim, Alemania	4898117001
Kit CloneJET de clonación PCR	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
Agarosa	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania	A9539-500G
Kit QIAquick de extracción de gel	QIAGEN, Hilden, Alemania	28704
E. coli competentes NEB 10-beta	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Alemania	C3019I
Kit QIAquick de minipreparación	QIAGEN, Hilden, Alemania	27104
Enzima de restricción HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Alemania	R3104S
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Alemania	31966-021
Suero bovino fetal (FBS)	Biosera, Boussens, Francia	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, Mannheim, Alemania	E2311	puede sustituirse por el reactivo de transfección de elección
Kanamicina	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania	K0129
Células Vero	ATCC, Manassas, VA, EE. UU.	CCL81
Placas de 6 pocillos	Neolab, Heidelberg, Alemania	353046