Producción y recolección de células epiteliales terapéuticas productoras de virus

Resumen

Fuente: Heidbuechel, J. P., et al.Virus paramixovirales para la inmunomodulación dirigida a tumores: diseño y evaluación ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra el proceso de infectar células epiteliales renales con virus modificados genéticamente para su producción y recolección, con el fin de estudiar la replicación viral.

Protocolo

1. Determinación de las capacidades replicativas y citotóxicas de vectores virales que codifican inmunomoduladores

Compare la cinética de replicación del virus recombinante generado y del vector no modificado mediante curvas de crecimiento de un solo paso o de varios pasos (GC). En las GC de un solo paso, se evalúa la descendencia viral tras la infección simultánea de todas las células (teóricamente, 100 % de infección). Las GC de varios pasos comienzan con un bajo porcentaje de células infectadas para seguir varias rondas de replicación viral.

1. Para el análisis de la cinética de replicación del virus del sarampión, siembre 1 x 10⁵ células Vero en 1 mL de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) con 10% de SFB (suero bovino fetal) por pocillo en placas de 12 pocillos un día antes de la infección. Plaque al menos dos pocillos para cada punto temporal de interés como réplicas técnicas.
2. Infecte las células con el virus a una baja MOI (multiplicidad de infección) para curvas de crecimiento multietapa o a una alta MOI para curvas de crecimiento en un solo paso (0,03 y 3 para MV o virus del sarampión, respectivamente) en células Vero. Reemplace el medio con 300 µL de medio sin suero que contenga la cantidad respectiva de virus e incube a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 2 h. Retire el inóculo, agregue 1 mL de DMEM con 10% de SFB y continúe la incubación.
3. En puntos temporales relevantes, como 12, 24, 36, 48, 72 y 96 h posteriores a la infección, recolecte la progenie viral raspando directamente las células en el medio. Transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo individual, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C hasta la titulación.
   NOTA: Las muestras replicadas pueden agruparse en esta etapa para el análisis de títulos promedio.
4. Recoja muestras de todos los puntos temporales. Déscongele simultáneamente a 37 °C para evaluar la progenie viral. Agite en vórtex y precipite los restos celulares mediante centrifugación durante 5 min a 2.500 x g y 4 °C.
5. Calcule los títulos promedio de cada constructo y punto temporal según se describió anteriormente. Represente gráficamente los títulos en función del tiempo. Compare las curvas de crecimiento de vectores con y sin transgenes insertados, con diferentes transgenes o con transgenes insertados en posiciones distintas (véase Figura 1).

Resultados

Figura 1: Cinética de replicación y actividad lítica de virus del sarampión recombinantes. (A) Se generaron curvas de crecimiento en un solo paso tras la infección de células Vero con el virus del sarampión oncolítico no modificado (MV) o con el virus del sarampión que codifica un enganchador bispecífico de células T (MV-H-mCD3xhCD20) a una MOI de 1. Se evaluaron los títulos de la progenie viral en los puntos de tiempo indicados tras la infección, lo que indica cinéticas de replicación viral similares. Se muestran las medias y desviaciones estándar de ocho muestras (cuatro réplicas técnicas de cada una de dos réplicas biológicas por punto de tiempo). (B) La viabilidad celular se evaluó en células de carcinoma colorrectal murino MC38 que expresan de forma estable el antígeno carcinoembrionario humano y el receptor del MV CD46 (MC38-CEA-CD46), tras la inoculación con medio únicamente (control) o con los virus indicados a una MOI de 1. Se realizó el ensayo de viabilidad celular XTT en los puntos de tiempo indicados. Se observó una reducción en la viabilidad celular en puntos de tiempo más tempranos para el vector no modificado. Valores superiores al 100%, como los calculados para MV-H-mCD3xhCD20 en el punto de tiempo de 12 h, se observan frecuentemente poco después de la infección, lo cual podría deberse a estrés celular o a factores derivados de las células presentes en la suspensión del virus. Se muestran los valores medios más desviaciones estándar de tres réplicas técnicas para cada punto de tiempo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Alemania	31966-021	Utilizado para la siembra e infección de células Vero
Suero Bovino Fetal (FBS)	Biosera, Boussens, Francia	FB-1280/500	Para suplementación del DMEM
Células Vero	ATCC, Manassas, VA, EE. UU.	CCL81	Células huésped para la propagación y ensayo del virus del sarampión
Placas de 12 pocillos	Neolab, Heidelberg, Alemania	353043	Para la siembra de células Vero (1 × 10⁵ por pocillo)
Opti-MEM (medio sin suero)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemania	31985070	Para el paso de infección viral (incubación sin suero)
Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemania	14190-094	Para lavado y preparación del medio
Elevador celular	Corning, Reynosa, México	3008	Utilizado para raspar las células infectadas durante la recolección
Tubos de 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Alemania	02-572-3001	Para recolección de muestras y centrifugación
Nitrógeno líquido	—	—	Para congelación rápida de las muestras virales recolectadas
Centrífuga (capaz de alcanzar 2.500 × g)	—	—	Para sedimentar los restos celulares
Kit de Viabilidad Celular XTT (Kit Colorimétrico de Viabilidad Celular III)	PromoKine, Heidelberg, Alemania	PK-CA20-300-1000	Incluye reactivo XTT; para la medición de citotoxicidad
Placas de 96 pocillos, fondo plano	Neolab, Heidelberg, Alemania	353072	Para medición de absorbancia a 450 nm
Espectrofotómetro / Lector de microplacas	—	—	Para medir la absorbancia óptica a 450 nm (referencia 630 nm)
Incubadora de dióxido de carbono	—	—	37 °C, 5 % CO₂ para todas las incubaciones celulares