Evaluación de la actividad inmunomoduladora de un enganchador de células T bispecífico codificado viralmente

Resumen

Fuente: Heidbuechel, J. P., et al.. Paramixovirus para la inmunomodulación dirigida a tumores: diseño y evaluación ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra un ensayo celular para evaluar la actividad inmunomoduladora específica frente al blanco de un enganchador bispecífico de células T (BTE) codificado por un virus. El BTE une células tumorales que expresan un receptor diana con células T, desencadenando la lisis tumoral y la liberación de enzimas. Una lectura colorimétrica, basada en la conversión del sustrato, indica la activación de las células T. Una mayor intensidad de color en la muestra de prueba confirma el reclutamiento inmune mediado por BTE y específico del receptor.

Protocolo

1. Evaluar la funcionalidad inmunológica de inmunomoduladores aislados.
   1. A continuación se describe detalladamente cómo evaluar la citotoxicidad mediada por células inducida por el enganche bispecífico de linfocitos T (BTE) mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
      1. Decidir las condiciones que se probarán durante el experimento (véase Figura 1 como ejemplo). Pueden variarse los puntos temporales (horas a días), las concentraciones del inmunomodulador (de pg/mL a µg/mL) y las relaciones efectora a diana (E:T) (por ejemplo, entre 1:50 y 50:1). Siempre preparar muestras por triplicado.
      2. Incluir muestras sin proteína BTE y sin células efectoras, controles para la liberación espontánea de LDH de los tipos celulares individuales (Tsp y Esp), un control de lisis máxima de células diana (Tmax) con detergente añadido antes de la lectura, un control con medio únicamente y un control de volumen para Tmax.
         NOTA: Los números requeridos de células diana y los tiempos de incubación pueden variar. Realizar corridas iniciales de prueba sin células efectoras ni inmunomoduladores para identificar los parámetros óptimos. Incluir muestras Tsp y Tmax y sus controles correspondientes para evaluar diferentes números de células y puntos temporales.
      3. Aislar células efectoras inmunes (por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de sangre humana para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o selección negativa de linfocitos T murinos a partir de esplenocitos de ratón).
      4. Siembrar células diana (por ejemplo, 5 x 10³ por pocillo) en una placa de 96 pocillos con fondo en U.
      5. Añadir la proteína aislada a las concentraciones deseadas a las muestras respectivas. Añadir células efectoras inmunes en las relaciones deseadas. Añadir medio hasta un volumen total de 100 µL por pocillo.
      6. Incubar durante el período determinado, típicamente entre 4 y 48 h (24 h para PBMCs no estimulados y 48 h para linfocitos T murinos recién aislados; tiempos de incubación más cortos pueden aplicarse para células inmunes previamente estimuladas), a 37 °C y 5% CO₂.
      7. 45 minutos antes de recoger las muestras, añadir 10 µL de solución de lisis 10x a los pocillos que contienen las muestras Tmax y los controles de medio correspondientes. Continuar la incubación.
      8. Centrifugar las células a 250 x g durante 4 min. Transferir 50 µL de cada sobrenadante a una placa de 96 pocillos con fondo plano. No transferir células para evitar la LDH ligada a células.
      9. Preparar la solución sustrato según las instrucciones del fabricante. Añadir 50 µL a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente [RT] en la oscuridad durante 30 min o hasta que las muestras Tmax adquieran un color rojo intenso.
      10. Añadir 50 µL de solución de parada a cada pocillo. Eliminar las burbujas mediante centrifugación durante 1 min a 4,000 x g y manualmente con una aguja hueca. Medir la absorbancia óptica a 490 nm.
      11. Calcular los valores de lisis específica porcentual para cada muestra.
          1. Calcular los promedios para los replicados de los controles de medio con y sin solución de lisis. Restar los valores obtenidos de las muestras experimentales y de los controles Tmax y de liberación espontánea, respectivamente. Utilizar estos valores corregidos por fondo para cálculos posteriores.
          2. Calcular los promedios para los controles Tmax, Tsp y Esp corregidos por fondo. Utilizando estos valores promedio, la siguiente ecuación proporciona el porcentaje de lisis específica para cada muestra:
             
          3. Representar gráficamente los valores de lisis específica porcentual frente a la concentración de proteína o la relación E:T y compararlos con las muestras de control no dirigidas.

Resultados

Figura 1: Actividad citotóxica de los BTE codificados por el virus del sarampión. Las células tumorales diana (5 x 10³ células B16-CD20-CD46 por pocillo) se incubaron con células T murinas en una proporción de 1:50. Los BTE (enganchadores bispecíficos de células T) previamente purificados del sobrenadante de células infectadas con MV (virus del sarampión)-H-mCD3xhCD20 se añadieron a las concentraciones indicadas. La lisis relativa de las células diana se evaluó mediante el ensayo de liberación de LDH tras 48 h. Las células que carecían del antígeno diana del BTE (B16-CD46) sirvieron como referencia para evaluar la citotoxicidad específica del antígeno. Se muestran las medias más las desviaciones estándar de tres réplicas técnicas por muestra. Las células que expresaban el antígeno diana fueron lisadas de manera específica dependiente de la concentración del BTE. La pureza del producto BTE y los niveles de expresión del antígeno diana influyen en la eliminación celular. En el presente ejemplo, se logró un 15 % de muerte celular específica a una concentración relativamente alta de BTE de 1 µg/mL. Este es un valor típico para este tipo de configuración experimental con tiempos prolongados de coincubación y condiciones subóptimas de cultivo de células T. En otros casos, se ha alcanzado hasta un 60 % de eliminación específica utilizando BTE purificados de sobrenadantes de células infectadas con MV, alcanzando una meseta a concentraciones de BTE de 100 ng/mL o superiores. Esto indica que, contrariamente a lo esperado, el límite de este ensayo es inferior al 100 % de muerte celular específica, lo cual puede explicarse por diferentes cinéticas de crecimiento en los controles Tmax comparados con las muestras de cocultivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Alemania	31966-021
Suero bovino fetal (FBS)	Biosera, Boussens, Francia	FB-1280/500
Kanamicina	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		disponible bajo solicitud
Kit colorimétrico de viabilidad celular III (XTT)	PromoKine, Heidelberg, Alemania	PK-CA20-300-1000	incluye reactivo XTT
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemania	14190-094
Columnas de centrifugación QIAquick Ni-NTA	QIAGEN, Hilden, Alemania	31014
Placas de 96 pocillos, fondo redondeado	TPP, Trasadingen, Suiza	92097
Placas de 96 pocillos, fondo plano	Neolab, Heidelberg, Alemania	353072