La identificación de los efectos de las mutaciones BRCA1 en recombinación homóloga utilizando células que expresan endógeno de tipo salvaje BRCA1

Resumen

Ofrecemos un método para probar variantes de BRCA1 en un ensayo de cultivo de tejidos para la reparación basada en la recombinación homóloga de ADN dañado por el agotamiento de la proteína BRCA1 endógena a partir de una célula utilizando ARN de interferencia y su sustitución por un mutante BRCA1 punto que contiene un cambio de codificación.

Resumen

El análisis funcional de las mutaciones sin sentido puede ser complicado por la presencia en la célula de la proteína endógena. Estructura-función de los análisis de los genes BRCA1 se han complicado por la falta de una prueba sólida de la proteína de longitud completa BRCA1 y las dificultades inherentes a la utilización de líneas celulares que expresan la proteína BRCA1 hypomorphic ^1,2,3,4,5. Hemos desarrollado un sistema mediante el cual se agotó la proteína BRCA1 endógeno en una célula de forma aguda por RNAi dirigidas a la 3'-UTR del ARNm de BRCA1 y reemplazado por la co-transfección de un plásmido que expresa una variante BRCA1. Una de las ventajas de este procedimiento es que el silenciamiento aguda de la sustitución de los genes BRCA1 y simultánea permiten que las células crezcan sin mutaciones secundarias o adaptaciones que puedan surgir con el tiempo para compensar la pérdida de la función de BRCA1. Este agotamiento y el procedimiento add-back se llevó a cabo en una línea celular HeLa derivados que se ensayó con facilidad para la actividad de recombinación homóloga. El ensayo de recombinación homóloga se basa en un método previamente publicado por el cual se integra un sustrato de la recombinación en el genoma (Figura 1) ^6,7,8,9. Este sustrato tiene la rara recombinación de corte I-II CPE sitio de la enzima de restricción dentro de un alelo inactivo GFP, y aguas abajo es un segundo alelo GFP inactivo. Transfección del plásmido que expresa la I-SCE ocasiona una ruptura de doble cadena, que pueden ser reparados por la recombinación homóloga, y si la recombinación homóloga no reparar la ruptura que crea un alelo GFP activo que es fácilmente marcado por citometría de flujo para la expresión de la proteína GFP . El agotamiento de los genes BRCA1 endógena produjo una reducción de 8 a 10 veces en la actividad de recombinación homóloga, y add-back de tipo salvaje función plásmido recombinación homóloga totalmente restaurada. Cuando los mutantes de puntos específicos de los genes BRCA1 longitud total se expresa a partir de co-transfectadas plásmidos, el efecto de los mutantes sin sentido específico se pudo calificar. A modo de ejemplo, la expresión de los genes BRCA1 (M18T) de proteína, una variante de significado desconocido clínica ^10, se expresa en estas células, que no pudo restaurar BRCA1 dependientes de la recombinación homóloga. Por el contrario, la expresión de otra variante, también de significado desconocido, BRCA1 (I21V) totalmente restaurada BRCA1 dependiente de recombinación homóloga función. Esta estrategia de las pruebas de la función de los genes BRCA1 mutaciones sin sentido se ha aplicado a otro sistema biológico ensayo para la función del centrosoma (Kais y otros, observaciones no publicadas). En general, este enfoque es adecuado para el análisis de mutantes sin sentido en cualquier gen que se deben analizar recesiva.

Protocolo

1. Línea celular con un sustrato de recombinación integrado

1. Las células HeLa fueron transformados de forma estable con el PDR-GFP (plásmido ⁷ regalo de M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) y se mantiene en puromicina para la selección de los transformantes.
2. Las células se pasan en DMEM / FBS, que contiene 10% de suero fetal bovino, 2 mM Glutamax, 1 mM piruvato sódico, a la penicilina / estreptomicina (100 U / mL/0.1 mg / ml), y 1,5 puromicina ug / mL.

El sustrato de la recombinación en el PDR-GFP plásmido, y en los transformantes estables, contiene dos alelos inactivos de las buenas prácticas agrarias (Figura 1). Un alelo está inactivo debido a la inclusión en su secuencia de codificación de la página 18 pb restricción de reconocimiento de enzimas para la I-SCE. Expresión de I-SCE en estas células crea un salto de ADN de doble cadena (DSB). Hay un segundo alelo de GFP inactivo en este ADN, pero la parte de su secuencia relacionada con el sitio I-SCE en el primer alelo es de tipo salvaje. Este alelo GFP segundo puede funcionar como una secuencia de donantes para la reparación de recombinación homóloga del OSD y se traduciría en un alelo GFP activo, que es fácilmente detectado por citometría de flujo. Por otra parte, el OSD podría ser reparado por la unión de extremos no homólogos, lo que destruiría el sitio de restricción I-SCEI y daría lugar a las buenas prácticas agrarias-negativos células. El nivel de recombinación homóloga en una celda se determina contando el porcentaje de las buenas prácticas agrarias de células positivas.

Esta línea celular, pHeLa-DR13-9, fue seleccionado entre todos los clones de la señal cero GFP de fondo y un porcentaje relativamente alto de las buenas prácticas agrarias de células positivas a la transfección con el I-SCE expresar pCBASce plásmido. (El pCBASce y su control de vectores, pCAGGS, fueron suministrados por M. Jasin del Centro del Cáncer Memorial Sloan-Kettering.)
La línea HeLa-DR13-9 está disponible de células de los autores que lo soliciten.

2. Transfección de BRCA1 agotan endógenos y añadir de nuevo mutante BRCA1.

1. El día antes de la transfección primero (por lo general un martes): Comience con un plato de 10 cm de HeLa-DR13-9 células de al menos el 90% confluente.
2. Trypsinize en 1 ml y detener la reacción mediante la adición de 9 ml DMEM / FBS, se mezcla bien con la pipeta.
3. Añadir 40 l de células con tripsina por pocillo de una placa de 24 pocillos de 0,5 ml de DME / FBS.
4. Día 1 transfecciones (miércoles): las células deben ser confluentes ~ 40-50%, aunque mucho menos empezar de nuevo. Transfectar mediante la mezcla de: 5 siRNA pmol + 0,3 ug-mutante BRCA1 expresión de ADN plásmido en el 12,5 l Opti-MEM, y 0,5 l Lipofectamine 2000 en 12,5 l Opti-MEM. Proceder a la transfección de acuerdo con el protocolo Lipofectamine (Invitrogen).
5. Vuelva a colocar los medios de comunicación 4-6 horas más tarde. El siRNA se utiliza para agotar BRCA1 se basa en la secuencia que especifica GCUCCUCUCACUCUUCAGU BRCA1 3'-UTR secuencias de 80.780 a 80.798 (número de acceso AY273801).
6. Día 2: Traslado de las células por trypsinizing de la placa y 24 a una placa de 6 pocillos.
7. Día 3 transfecciones: 25 pmol siRNA + 0,75 ug-mutante BRCA1 expresión de ADN plásmido + 0,75 ug pCBASce (o pCAGGS control de vectores) en el 62,5 l Opti-MEM y 2,5 l Lipofectamine 2000 en el 62,5 l Opti-MEM. Vuelva a colocar los medios de comunicación 4-6 horas más tarde.

3. Análisis de los transfectantes.

1. El día 6, trypsinize células de cada pocillo y dejar en 1 ml de DMEM / FBS. Análisis de las células para la expresión de GFP se puede hacer en los días 5 y 7, pero nos encontramos con que el día 6 que funciona mejor.
2. Analizar 10.000 células por pocillo por citometría de flujo. Utilizamos un Becton Dickinson FACSCalibur instrumento en la Ohio State University Comprehensive Cancer Center de Citometría de recursos compartidos de análisis. Las células individuales, en vivo son cerradas con los parámetros de dispersión frontal y lateral. Las buenas prácticas agrarias de células positivas se detectan mediante el detector de fluorescencia de GFP (FL1), y los resultados se presentan en forma de histograma (Figura 2, abajo).
3. Izquierda sobre las células puede ser replated para la fotografía de microscopía de fluorescencia, si lo desea.

4. Los resultados representativos:

BRCA1 regula la vía para la reparación de roturas de doble cadena de ADN por recombinación homóloga ^6,11. Las células que han sido sometidos a reparación por recombinación homóloga son fácilmente detectados por microscopía de fluorescencia (Figura 2, arriba). El agotamiento de los resultados de BRCA1 en una disminución de la GFP-positivas detectadas células (Figura 2, derecha). La salida de la FACSCalibur es un histograma con intensidad por las buenas prácticas agrarias de células en el eje X y el número de células en el eje Y (Figura 2, abajo). En un conjunto típico de los resultados de un experimento único, el 15,5% de las células fueron GFP-positivo después de la I-II CPE expresión y el control de agotamiento de RNAi (Figura 3). En comparación, el agotamiento de los genes BRCA1 y añadir de nuevo vector GFP reduce la conversión de hasta el 0,7%. Add-back de tipo salvaje BRCA1 o de los genes BRCA1 (I21V) totalmente restaurada la recombinación homóloga, según lo detectado por la obtención de un 15-16% de las células GFP positivos. Add-back de los genes BRCA1 (M18T) mutante (Figura 3, carril 5) tuvo un efecto similar a la extensión posterior de la lucha contra los vectores. Desde esta variante expresa en niveles similares a la proteína endógena ^9, los intérpretes de los genes BRCA1 (M18T) la variante no es funcional en la recombinación homóloga.

Por lo general tienen un 10-20% de las células convierten a GFP-positivo después de la transfección de la expresión I-SCE plásmido. El agotamiento de los genes BRCA1 y reproducen reduce la conversión de las buenas prácticas agrarias de células positivas en alrededor de 8.10 veces. Aunque los porcentajes reales de las buenas prácticas agrarias de células positivas pueden cambiar de un experimento a experimento, la proporción de las buenas prácticas agrarias de células positivas tras el agotamiento de BRCA1 en relación con el agotamiento de control dentro de un experimento es bastante consistente. Normalizamos los resultados mediante el establecimiento de la tasa de conversión sin restricciones a 100% y los resultados de expresar con el agotamiento BRCA1 y añadir la espalda-en forma de porcentajes. De esta forma, podemos combinar múltiples experimentos, y la variación experimental no es muy alta.

Añadir de nuevo de los mutantes BRCA1 han arrojado resultados sólidos: cada variante BRCA1 o ha restaurado completamente homóloga actividad de recombinación o ha tenido ningún efecto. Una consideración importante en la obtención de estos resultados es que nuestras condiciones de transfección producir niveles de la proteína BRCA1 que aproximadamente igual a la concentración de la proteína endógena en las células no tratadas. Demasiado alto de una sobreexpresión de un mutante incluso defectuosa del gen BRCA1 pueden dar lugar a algún tipo de actividad de recombinación homóloga positivo.

Un problema que tuvimos que superar fue la toxicidad de la transfección. El agotamiento de los genes BRCA1 se puede retrasar el crecimiento celular y el equilibrio de ADN Lipofectamine-2000 y el plásmido en relación con el número de células en el plato debe mantenerse en un nivel constante. ADN demasiado Lipofectamine plásmido o reducirá el número de células, y el número de células no serán suficientes para obtener resultados fiables de la citometría de flujo. El saldo de los reactivos Lipofectamine plásmido y contra el número de células transfectadas es muy importante para mantener la viabilidad de las células.

Figura 1. El sustrato recombinación. La estrategia que ha sido desarrollado por el grupo de M. Jasin ^7,12 se representa. El PDR-GFP plásmido contiene dos alelos defectuosos de las buenas prácticas agrarias, una de las cuales contiene un sitio de restricción de endonucleasa I-SCE. Una línea de células HeLa derivada contiene este sustrato de ADN integrados en un solo sitio en el genoma de ^9, y la reparación de activos de la ruptura del ADN de doble cadena en el sitio I-II CPE por los resultados de recombinación homóloga en la conversión de un alelo de GFP-positivas.

Figura 2. Detección de las buenas prácticas agrarias de células positivas por microscopía de fluorescencia. Las células fueron comprobados de acuerdo con este protocolo, y el control-agotadas las células se activa en la recombinación homóloga, detectada por un alto porcentaje de células con expresión de las buenas prácticas agrarias (izquierda). El agotamiento de los genes BRCA1 en los resultados de RNAi en una fuerte disminución en el número de células positivas para GFP (derecha).

Figura 3. Los resultados de un add-back de los mutantes missense BRCA1. Los resultados de un solo experimento se muestran en el histograma. En ausencia de transfectadas I-SCE expresar plásmido (carril 1) no hay células positivas GFP-detectados. Los resultados en los carriles 2-6 se tomaron todas las células en la que el I-SCE expresar plásmido se transfectadas en el día 3. En las células que se agotaron por un gen irrelevante (luciferasa) y con el vector add-back, el 15,5% de las células fueron GFP-positivo (carril 2). El agotamiento de los genes BRCA1 y vector add-back revela el efecto de la pérdida de BRCA1 en la recombinación homóloga (calle 3). Los efectos del agotamiento de los genes BRCA1 y add-back de tipo salvaje BRCA1 (calle 4), BRCA1 (M18T) (carril 5), y BRCA1 (I21V) (carril 6) se muestran. Estos resultados son de un solo experimento, y se puede combinar con al menos dos experimentos repetidos más con el fin de obtener una medida de la recombinación homóloga con el apoyo de una proteína mutante BRCA1 dado.

Discusión

La ventaja de este método es que se puede estudiar la función de la proteína BRCA1 en la regulación de la reparación del ADN por recombinación homóloga utilizando células que han de tipo salvaje BRCA1 endógena expresó. Hemos adoptado dos métodos para establecer de estudiar el proceso de recombinación homóloga y de la utilización de RNAi agotamiento para obtener el nuevo método para las pruebas de BRCA1 variantes de función en la reparación del ADN. La clave para el éxito de este método consistía en establecer una línea de células fácilmente transfectable, tales como HeLa, con el sustrato de la recombinación en el genoma de tal manera que se obtienen altos niveles de conversión de las buenas prácticas agrarias. Hemos tenido múltiples clones seleccionados de la transformación original con el fin de obtener una que no tenía ninguna señal de fondo GFP detectable, pero a la transfección de la expresión I-SCE plásmido tenía un nivel muy alto de conversión de las buenas prácticas agrarias.

Con este método, se están investigando otros residuos específicos BRCA1 aminoácidos para la función en la recombinación homóloga. Junto con los conocimientos biológicos de este trabajo, estas conclusiones se pueden aplicar a la genética del cáncer clínico. Un alto porcentaje de mutaciones missense BRCA1 tienen un significado clínico desconocido ya que hay muchas variantes raras y no hay información suficiente para muchos de estos para determinar la asociación del cáncer mediante análisis de la segregación genética ^3,10,13,14. Usando este método, las consecuencias de una variante específica de la función biológica de los genes BRCA1 en la regulación de la recombinación homóloga podría ser utilizado para informar a las mujeres que llevan una de estas variantes en su genoma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Invitrogen	11960
SFB	USA Scientific, Inc.	9871-5200
ARNsi	Invitrogen	N/A
Lipofectamina-2000	Invitrogen	11668
TrypLE	Invitrogen	12604
Puromicina	Enzo Life Sciences	BML-GR312
Opti-MEM I	Invitrogen	31985
Piruvato de sodio	Invitrogen	11360
GlutaMAX I	Invitrogen	35050
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen	15140