Rescate de viriones infecciosos a partir de células transfectadas con ARN sintético derivado de un cromosoma artificial bacteriano

Resumen

Fuente: Yun, S. et al. Cromosomas Artificiales Bacterianos: Una Herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de los Virus de ARN de Hebra Positiva. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra la recuperación del virus de la encefalitis japonesa infeccioso a partir de ARN sintético transcrito de un clon de cromosoma artificial bacteriano. Muestra cómo se electroportan las células con el ARN sintético, permitiendo que el genoma viral dirija la producción de nuevas partículas virales. Las placas resultantes formadas en monocapas celulares infectadas confirman el rescate exitoso del virus infeccioso.

Protocolo

1. Determinar la infectividad del ARN y el rendimiento de virus

1. Cultive células de riñón de hámster bebé-21 (BHK-21) en placas de cultivo de 150 mm a una densidad de 3 × 10⁶ células/placa durante 24 h a 37 °C con 5% de CO₂.
   NOTA: Mantenga las células BHK-21 en medio mínimo esencial alfa suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina, vitaminas y penicilina/estreptomicina.
2. Lave la monocapa celular con 10 ml de la Solución A fría (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8,1 mM de Na₂HPO₄ y 1,5 mM de KH₂PO₄). Desprenda las células de las placas mediante tratamiento con 4 ml de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,25%) y recójalas por centrifugación a 270 × g en una centrífuga de sobremesa durante 2 min.
3. Reuspenda el sedimento celular con 50 ml de Solución A fría en un tubo cónico de 50 ml y centrifugue la suspensión celular a 270 × g durante 2 min. Repita este procedimiento de lavado tres veces; tras el último lavado, resuspenda el sedimento celular a una densidad de 2 × 10⁷ células/ml en la Solución A.
4. Mezcle un alícuota de 400 µl de suspensión celular con 2 µg de ARN sintético en una cubeta de 2 mm de separación e introduzca inmediatamente la mezcla por electro poración con un electro por ador bajo condiciones óptimas de electro por ación: 980 V, duración del pulso de 99 µs y 5 pulsos (Figura 1C).
5. Deje las células electro por adas a temperatura ambiente (TA) durante 10 min y transfiéralas a un microtubo de 1,7 ml que contenga 600 µl de medio de cultivo completo.
6. Prepare una dilución seriada de 10 veces de las células electro por adas en 1 ml de medio de cultivo completo y siembre un alícuota de 100 µl de cada dilución sobre las monocapas de células BHK-21 no electro por adas (5 × 10⁵) en una placa de 6 pocillos.
7. Tras 4-6 h de incubación, recubra las células con agarosa al 0,5% en medio mínimo esencial que contenga 10% de suero bovino fetal. Incube las placas durante 4 días a 37 °C con 5% de CO₂.
8. Visualice los centros infecciosos (placas) mediante fijación con formaldehído al 7% y tinción con violeta de cristal al 1% en etanol al 5% (Figura 2A).
   1. Opcional: Examine las células electro por adas con ARN a las 18-20 h posteriores a la transfección para detectar la expresión de proteínas del virus de la encefalitis japonesa (JEV) mediante ensayos de inmunofluorescencia (Figura 2B), y recoja los sobrenadantes de las células electro por adas con ARN a las 22 y 40 h posteriores a la transfección para la titulación del virus mediante ensayos de placas (Figura 2C).

Resultados

Figura 1. Vista general de la recuperación de virus infecciosos a partir de un ADN complementario (cADN) completo de JEV SA₁₄-14-2 ensamblado en un cromosoma artificial bacteriano (BAC). (A) Linealización de la plantilla de cADN. El BAC completo de JEV se corta con XbaI y se trata con nucleasa de alubia mungo (MBN). (B) Síntesis de los transcritos de ARN. El cADN linealizado se transcribe mediante la ARN polimerasa SP6 en presencia del análogo de caperuza m⁷G(5')ppp(5')A. (C) Recuperación de los virus sintéticos de JEV. Los ARN transcritos in vitro se transfectan en células BHK-21 mediante electrotransferencia, lo que genera una alta titulación de virus sintético.

Figura 2. Infectividad específica de los ARN sintéticos transcritos a partir de un BAC completo de JEV y recuperación del virus sintético. Las células BHK-21 se electroporan simuladamente (Mock) o se electroporan con los transcritos de ARN derivados de cada uno de los dos clones independientes del BAC completo de JEV (Cl.1 y Cl.2). (A) Infectividad del ARN. Las células se recubren con agarosa y se tiñen con violeta de cristal a los 4 días posteriores a la transfección. La infectividad del ARN se determina mediante ensayos de centros infecciosos para estimar la cantidad de ARN infeccioso electroporado en las células (panel izquierdo). Asimismo, se muestran imágenes representativas de los centros infecciosos (panel derecho). (B) Expresión proteica. Las células se cultivan en portaobjetos con cámaras de 4 pocillos. La expresión de proteínas virales en células electroporadas con ARN a las 20 horas posteriores a la transfección (hpt) se analiza mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un suero antiproteína no estructural 1 (NS1) de conejo como anticuerpo primario y una inmunoglobulina G (IgG) de cabra anti-conejo conjugada con Cy3 (rojo) como anticuerpo secundario. Los núcleos se contratinjan con 4',6-diamidino-2-fenilindol (azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se superponen sobre sus imágenes correspondientes de contraste por interferencia diferencial. (C) Rendimiento viral. Las células se cultivan en placas de cultivo de 150 mm. La producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de las células electroporadas con ARN a las 22 y 40 horas posteriores a la transfección (hpt) se examina mediante ensayos de placas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Mínimo Esencial Alfa	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agarosa	Lonza	50004
Tubo cónico (50 mL)	VWR	21008-242
Violeta de cristal	Sigma-Aldrich	C0775
Placa de cultivo (150 mm)	TPP	93150
Cubeta (intervalo de 2 mm)	Harvard Apparatus	450125
Suero bovino fetal	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehído	Sigma-Aldrich	F1635	Tóxico y carcinogénico
Glutamina	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Medio Mínimo Esencial	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicilina/estreptomicina	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato monobásico de potasio	Sigma-Aldrich	P9791
Placa de seis pocillos	TPP	92006
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato dibásico de sodio	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsina-EDTA (0,25 %)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitaminas	Sigma-Aldrich	M6895
Incubadora de CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrífuga de banco	Thermo Scientific	ST16R
Electroporador	Harvard Apparatus	ECM 830