El desarrollo temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se caracteriza por una serie de cambios en la forma de células que se presta a los enfoques de imagen. En este artículo se describen las herramientas básicas y los métodos necesarios para la imagen confocal en vivo de embriones de Drosophila, y se centrará en un cambio de forma de la célula llamado cellularization.
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Artículo de método
Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo de Drosophila melanogaster embrión sufre una serie de cambios en la forma de células que son muy susceptibles de imagen confocal en vivo. Cambios en las células de la mosca de la forma son análogos a los de organismos superiores, y conducen la morfogénesis de tejidos. Por lo tanto, en muchos casos, su estudio tiene implicaciones directas para la comprensión de enfermedades humanas (Tabla 1) 1-5. En la escala sub-celular, cambios en la forma celular son el producto de actividades que van desde la expresión de genes de transducción de señales, la polaridad celular, la remodelación del citoesqueleto y el tráfico de la membrana. Por lo tanto, el embrión de Drosophila no sólo proporciona el contexto para evaluar cambios en las células la forma como se relacionan con la morfogénesis de tejidos, sino que también ofrece un entorno totalmente fisiológica para estudiar las actividades sub-celular que las células de forma.
El protocolo aquí descrito está destinado a la imagen de un cambio de células forma específica llamada cellularization. Cellularization es un proceso de crecimiento espectacular membrana plasmática, y en última instancia, convierte el embrión sincitial en el blastodermo celular. Es decir, en la interfase del ciclo mitótico 14, la membrana plasmática al mismo tiempo se invagina alrededor de cada uno de los núcleos de ~ 6000 cortical anclado para generar una hoja de primaria células epiteliales. En contra de las sugerencias anteriores, cellularization no está impulsado por la miosina-2 contractilidad 6, sino que está impulsada en gran parte por la exocitosis de la membrana interna de las tiendas 7. Por lo tanto, cellularization es un excelente sistema para estudiar el tráfico de membrana durante los cambios de forma de la célula que requieren invaginación de la membrana plasmática o de expansión, como la citocinesis o transversal de túbulos (T-túbulo) morfogénesis en el músculo.
Tenga en cuenta que este protocolo se aplica fácilmente a las imágenes de otros cambios en las células forma en el embrión de la mosca, y sólo requiere de pequeñas adaptaciones como el cambio de la etapa de recolección de embriones, o el uso de "pegamento embrión" para montar el embrión de una orientación específica (Tabla 1) 19.8. En todos los casos, el flujo de trabajo es básicamente el mismo (Figura 1). Los métodos estándar para la clonación y la transgénesis Drosophila se utilizan para preparar acciones mosca de establo que expresan una proteína de interés, fusionado a la proteína verde fluorescente (GFP) o sus variantes, y las moscas son una fuente renovable de los embriones. Por otra parte, las proteínas fluorescentes / sondas se introducen directamente en embriones de la mosca a través de técnicas sencillas de micro-inyección de 9-10. Entonces, dependiendo del evento de desarrollo y cambio en las células de forma para obtener imágenes, los embriones y puesta en escena por la morfología de un microscopio de disección, y finalmente colocado y montado para time-lapse en un microscopio confocal.
Protocolo
1. Ensamble Copas de recogida de embriones
- Corta el fondo de 100 ml de Tri-maíz vaso con una navaja, por lo que el borde lo más suave posible. Las copas son más fáciles de manejar si usted también recortar las tres esquinas fuera de la parte superior, aunque esto no es absolutamente necesario.
- Corte un cuadrado de tela metálica (6 cm x 6 cm). En un plato caliente precalentada, en el interior de una campana de extracción de capas, la plaza de malla de alambre en la parte superior de una hoja de papel de aluminio de alta resistencia. Empuje el borde inferior de corte de la taza bien caliente sobre la malla. Espere unos segundos, y levantar la copa ....
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Discusión
El protocolo se describe en este documento permitirá a la imagen en vivo, confocal de una serie de cambios en la forma de células en el embrión de la mosca en desarrollo. Las poblaciones de las buenas prácticas agrarias para la imagen puede ser preparado por un laboratorio individual (Tabla 2), pero muchas de esas poblaciones también están a disposición del público de los centros, tales como Bloomington Drosophila Stock Center en la Universidad de Indiana ( http://flys.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Queremos agradecer a Eric Wieschaus, que proporcionó el fundamento sobre el cual se desarrolló este protocolo. Nuestro trabajo es apoyado por un Departamento de Verna y Marrs McLean de Bioquímica y Biología Molecular de la puesta en marcha Premio, Baylor College of Medicine.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Láminas | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Cubreobjetos 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Botellas con gotero (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| Tubos Falcon de 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Peras para pipetas pequeñas, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Viales de centelleo con tapas | VWR international | 66021-533 | |
| Probetas Tri-Corn, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| Placa de Petri BD Falcon 60x15 mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| Filtro celular BD Falcon | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Puntas de pipeta amarillas | Rainin | L200 | |
| Malla de acero inoxidable, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Pipetas Pasteur de vidrio de 5¾ pulgadas | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Papel de filtro P4 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Ligas elásticas | Office Max | A620645 | |
| Cinta adhesiva doble cara Scotch, ½ pulgada | Office Max | A8137DM-2 | |
| Pinceles para pintar Robert Simmons Expression E85 redondo n.º 2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Pinzas Dumont n.º 5, de alta precisión, inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| Cuchillas de afeitar | VWR international | 55411-050 | |
| Aceite de halocarbono 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptano | Fisher Scientific | H360-1 | |
| Agar BD Bacto | VWR international | 90000-760 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Ácido p-hidroxibenzoico | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Levadura seca activa Red Star | LeSaffre | 15700 | |
| Toallas de papel, dobladas en C | Kleenex | ||
| Foil de aluminio pesado | Reynolds Wrap | ||
| Lejía | Austin’s A-1 Commercial | ||
| Jugo de manzana al 100 % | Ocean Spray o Tree Top |
Referencias
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
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Reimpresiones y permisos
