Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

Resumen

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Resumen

La capacidad de medir el metabolismo celular y comprender la disfunción mitocondrial, ha permitido a los científicos de todo el mundo para avanzar en su investigación en la comprensión del papel de la función mitocondrial en la obesidad, la toxicidad de la diabetes, el envejecimiento, el cáncer, la función cardiovascular y la seguridad.

El metabolismo celular es el proceso de asimilación del sustrato, tales como oxígeno, glucosa, ácidos grasos, y la glutamina, y la conversión de energía posterior a través de una serie de oxidación enzimática controlada y las reacciones de reducción. Estos resultados reacciones bioquímicas intracelulares en la producción de ATP, la liberación de los subproductos de calor y productos químicos, como el lactato y CO ₂ en el medio extracelular.

Información valiosa sobre el estado fisiológico de las células, y la alteración del estado de las células, se puede obtener a través de la medición de la tasa de oxígeno consumido por las células, un indicador de la respiración mitocondrial - La tasa de consumo de oxígeno - o OCR. Las células también generar ATP a través de la glucólisis, es decir: la conversión de glucosa a lactato, independiente de oxígeno. En los pozos de cultivo, el lactato es la principal fuente de protones. La medición del ácido láctico producido indirectamente a través de los protones liberados en el medio extracelular que rodea las células, lo que provoca la acidificación del medio proporciona la velocidad de acidificación extracelular - o ECAR.

En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia. Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula.

Este ensayo se deriva de un experimento clásico para evaluar las mitocondrias y sirve como un marco con el cual construir experimentos más complejos destinados a comprender la función tanto fisiológicas y fisiopatológicas de la mitocondria y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos.

Protocolo

En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia.

1. Inyección de células

Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula. Un grupo será el control, con el funcionamiento de los medios de comunicación añadido como el control de "compuestos".

1. La primera inyección se oligomicina. Oligomicina inhibe la síntesis de ATP por el bloqueo del canal de protones de la parte F sintetasa _o ATP (complejo V). En la investigación mitocondrial, que se utiliza para prevenir el estado 3 (fosforilación) la respiración. Con las células, que puede ser utilizado para distinguir el porcentaje de consumo de O2 dedicado a la síntesis de ATP y el porcentaje de consumo de O2 necesarios para superar la pérdida natural de protones a través de la membrana mitocondrial interna.
2. La segunda inyección se FCCP. FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) es un ionóforo que es un portador de iones móviles. Se trata de un agente de desacoplamiento, ya que altera la síntesis de ATP por el transporte de iones de hidrógeno a través de la membrana mitocondrial en lugar del canal de protones de la ATP sintasa (complejo V). Este colapso del potencial de membrana mitocondrial conduce a un rápido consumo de energía y oxígeno sin la generación de ATP. En este caso, tanto OCR y ECAR aumentará, debido al desacoplamiento de OCR, y ECAR como el intento de las células para mantener su balance de energía mediante el uso de la glucólisis para generar ATP.
   FCCP tratamiento se puede utilizar para calcular el "repuesto" la capacidad respiratoria de las células que se define como la diferencia cuantitativa entre el máximo y el OCR no controlada inicial OCR basal. Se ha propuesto que el mantenimiento de cierta capacidad respiratoria, incluso en condiciones de máxima estímulo fisiológico o fisiopatológico es un factor importante que define la vitalidad y / o supervivencia de las células. La capacidad de las células a responder al estrés en las condiciones de la demanda de energía se incrementa en gran parte influenciada por la capacidad bioenergética de la mitocondria. Esta capacidad bioenergética es determinada por varios factores, incluyendo la capacidad de la célula para ofrecer soporte a la mitocondria y la capacidad funcional de las enzimas implicadas en el transporte de electrones
3. En la tercera inyección, la rotenona, un inhibidor de Complejo I, se añade a las células. Esto se apagará la respiración mitocondrial y permitirá a ambas las fracciones mitocondrial y no mitocondrial-que contribuyen a la respiración que se calcula. Se observará una disminución de la OCR, debido a la función mitocondrial alterada, con un aumento concomitante de la ECAR que la célula se desplaza hacia un estado más glucolítico con el fin de mantener su balance energético
   La rotenona es un inhibidor mitocondrial que impide la transferencia de electrones desde el centro Fe-S en el Complejo I de la ubiquinona (coenzima Q). Esta inhibición del complejo I evita que la energía potencial de NADH se convierte en energía utilizable en forma de ATP.
   

2. Reactivos y materiales

1. Oligomicina, FCCP, y las soluciones de rotenona (Seahorse Estrés Mito Test Kit)
2. Ejecución de los medios DMEM (Seahorse # 100965-000)
3. DMSO (Sigma D8418)
4. Agua destilada (Gibco 15230-170)
5. Tampón de calibración (Seahorse Bioscience)

3. El crecimiento medio

1. 500 ml de DMEM (Gibco 11965-092)
2. 10% de SFB (Hyclone SH90070.03)
3. 5 ml Penn / estreptomicina (Gibco 15140-122)
4. 5 ml de piruvato de sodio (Sigma S8636)
5. 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061)

4. La siembra de Protocolo

1. Se siembran las células en cultivos de células XF96 placas con 10.000 células / pocillo en 100 L de medio de cultivo y se coloca en 37 ° C incubadora con 10% de CO _2.
2. Las células se adhieren a la placa de la célula XF96 cultura dentro de 1 hora.
3. Las células de ensayo en XF96 24 horas después de la siembra.

5. Preparación de la plantilla de ensayo

1. Utilizando el Asistente de ensayo (Anexo I), generar una plantilla con el diseño del siguiente grupo:
   
   Figura 1. Cuadrícula de diseño bien la identificación de las asignaciones de columna y el grupo

6. Preparación de compuestos

1. Preparar los siguientes compuestos en XF DMEM ensayo medios de comunicación de la siguiente manera:
   10 oligomicina uM, 30,0 uM FCCP, 20,0 M rotenona,
   Estas concentraciones representan la dilución de 10 veces que se hizo cuando los compuestos se inyecta en el pozo. Las concentraciones de trabajo son:
   1 oligomicina uM, 3,0 uM FCCP, rotenona 2.0 M

7. Medios de cambio y de preparación de células

Coloque la placa de la célula en la Estación de preparación XF
1. Ajuste el volumen final del medio a 160 l por pocillo.
2. Incubar a 37 ° C incubadora sin CO ₂ durante 60 minutos para permitir que las células pre-equilibrio con el medio de ensayo.

8. Sensor de carga del cartucho

1. Compuestos caliente a 37 ° C antes de la carga del cartucho del sensor y la carga de los compuestos en los puertos de inyección de la siguiente manera:
   1. Columnas 1-4: Cargar 16, 18 y 20 l de XF ensayo medios de comunicación (DMEM) en los puertos A, B y C, respectivamente.
   2. Columnas 5-12:
      Carga de 16 l de oligomicina en los puertos de A
      Cargar 18 L de FCCP en los puertos B
      Carga de 20 l de la rotenona en los puertos C

9. Comandos del Protocolo

Comando	Tiempo (min)	Puerto
Calibrar
Equilibrar
De inicio de bucle	3X
Mezcla	3
Esperar	2
Medida	3
Loop End
Inyectar		A
De inicio de bucle	2X
Mezcla	3
Esperar	2
Medida	3
Inyectar		B
De inicio de bucle	2X
Mezcla	3
Esperar	2
Medida	3
Inyectar		C
De inicio de bucle	2X
Mezcla	3
Esperar	2
Medida	3
Final

Tabla 1. Protocolo de comandos

Discusión

Este ensayo se deriva del experimento clásico para probar la función mitocondrial y sirve como marco de referencia para crear experimentos más complejos destinados a comprender los diversos cambios en el metabolismo celular, la función mitocondrial, y la bioenergética en general.

Todos los compuestos utilizados en este experimento deben ser optimizados para la concentración que proporciona el máximo efecto. Es decir, uno debe llevar a cabo experimentos separados de valoración para determinar estos valores. Esto es especialmente importante con FCCP, como la curva de valoración tiende a ser bastante fuerte, y FCCP demasiado en realidad puede disminuir las respuestas de OCR. Rangos típicos (concentraciones finales) para poner a prueba sería la siguiente:

• 0,1 a 1,0 ug / ml de oligomicina
• 0,1 a 5,0 uM FCCP
• 0,1 a 1,0 uM rotenona

Tenga en cuenta que las respuestas a cada compuesto anterior (especialmente FCCP) se verá influido por la composición de ensayo de los medios de comunicación (tipo base, [glucosa], [piruvato], la presencia / ausencia de BSA, etc.) Además, si el ensayo de los medios de comunicación XF composición se modifica la optimización será necesario volver a realizar. La presencia y concentración de piruvato es especialmente importante en la obtención de la capacidad respiratoria máxima debido a FCCP. Seahorse Bioscience ha observado en una serie de líneas de células que la omisión de piruvato anula la capacidad de las células a responder al máximo (por encima de línea de base) para FCCP. Por lo general, las concentraciones de piruvato 1-10 mm debe ser probado para entender la concentración óptima de piruvato para obtener la respiración máxima. Tenga en cuenta que [piruvato] Y [glucosa] puede ser necesario "cross-titulada" para obtener las condiciones óptimas para los medios de comunicación el experimento.

Los resultados típicos de este experimento se presentan a continuación en un gráfico que muestra OCR en función del tiempo y otra que muestra el tiempo frente a ECAR:

Figura 2. OCR frente a tiempo

Figura 3. ECAR frente a tiempo

Aquí observamos las respuestas esperadas en OCR y ECAR ya que las células se tratan con cada compuesto sucesivas. Para oligomicina, OCR disminuye como resultado de bloqueo de la síntesis de ATP mitocondrial en el Complejo V. Dado que las células son incapaces de sintetizar ATP a través de la fosforilación oxidativa, vuelven a la glicólisis para satisfacer su demanda de ATP, por lo que se observa un aumento de la ECAR. Como se indica anteriormente, FCCP actúa como un agente de desacoplamiento. Dado que las células deben ahora superar la pérdida de protones a través de la membrana mitocondrial interna, OCR aumenta significativamente a medida que más se consume O2 para bombear el exceso de protones al otro lado de la membrana mitocondrial. Por último, la rotenona inhibe la mitocondria del complejo I y III Complex, respectivamente, lo que hace que el flujo de electrones a cesar en la cadena de transporte de electrones, y por lo tanto el consumo de O2 se reduce drásticamente.

Figura 4. Respiración parámetros

Más allá de los cambios esperados en la respiración y la ECAR, una serie de parámetros respiratorios pueden ser obtenidos a partir de estos datos. Esto se resume en la figura anterior:

Aquí vemos que podemos obtener información acerca de la respiración basal de las células, el porcentaje de consumo de O2 dedicada a la producción de ATP, así como el monto destinado a mantener el gradiente de protones (H + debido a la fuga). Además, podemos obtener el máximo de la frecuencia respiratoria en condiciones de respiración desacoplada (a veces conocido como la capacidad respiratoria de repuesto) y, finalmente, podemos determinar la cantidad de consumo de O2 no se debe a los procesos de las mitocondrias.

Un creciente número de estudios que utilizan este perfil mitocondrial para evaluar la bioenergética celular, identificar la disfunción mitocondrial y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos. Para más información y detalles acerca de este método experimental y la idea de la capacidad respiratoria de repuesto, consulte refieren a las siguientes publicaciones ^1-8.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soluciones de oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A	Seahorse Bioscience		Kit de prueba de estrés mitocondrial Seahorse
Medio de funcionamiento DMEM	Seahorse Bioscience	100965-000
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Agua destilada	GIBCO, por Life Technologies	15230-170
Tampón de calibración	Seahorse Bioscience