Recogida de concentración variable conjuntos de datos calorimetría de titulación isotérmica para determinar los mecanismos de enlace

Resumen

ITC es una herramienta poderosa para el estudio de la unión de un ligando a su anfitrión. En los sistemas complejos sin embargo, varios modelos pueden adaptarse bien a los datos. El método descrito aquí proporciona un medio para dilucidar el modelo de encuadernación adecuado para los sistemas complejos y extraer los parámetros termodinámicos correspondientes.

Resumen

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se utiliza comúnmente para determinar los parámetros termodinámicos asociados a la unión de un ligando a una macromolécula de acogida. ITC tiene algunas ventajas sobre los enfoques comunes espectroscópicas para el estudio de host / ligando interacciones. Por ejemplo, el calor liberado o absorbido cuando los dos componentes interactúan se mide directamente y no requiere ningún periodista exógenos. Así, la entalpía de unión y de la constante de asociación (Ka) se obtienen directamente de los datos de ITC, y se puede utilizar para calcular la contribución entrópica. Además, la forma de la isoterma es dependiente de la c-valor y el modelo mecanicista involucrados. El valor de c se define como c = n [P] ATR, donde [P] t es la concentración de proteínas, y n es el número de sitios de unión del ligando dentro del huésped. En muchos casos, múltiples sitios de unión de un ligando dado no son equivalentes y el CCI permite la caracterización de los parámetros termodinámicos de unión para cada sitio de unión individual. Sin embargo, esto requiere que el modelo de enlace correcto utilizar. Esta elección puede ser problemático si los diferentes modelos pueden ajustarse a los datos experimentales. Hemos demostrado que este problema puede evitarse mediante la realización de experimentos en varias c-valores. Las isotermas de múltiples obtenidos en los diferentes valores de c-se ajustan al mismo tiempo a los modelos por separado. El modelo correcto es el siguiente identificados en base a la bondad de ajuste en toda la variable c conjunto de datos. Este proceso se aplica aquí a los aminoglucósidos resistencia a aminoglucósidos causan la enzima N-acetil-6'-II (AAC (6 ')-II). A pesar de nuestra metodología es aplicable a cualquier sistema, la necesidad de esta estrategia se demuestra mejor con un sistema de macromolécula-ligando muestra allostery o cooperatividad, y cuando los diferentes modelos de unión proporciona se ajusta esencialmente idénticos a los mismos datos. Por lo que sabemos, no hay sistemas disponibles en el mercado. AAC (6 ')-II, es un homo-dímero con dos sitios activos, que muestra cooperatividad entre las dos subunidades. Sin embargo, los datos de ITC obtiene en un solo valor de c se puede estar en forma igual de bien que al menos dos modelos diferentes de un modelo de dos conjuntos de sitios independientes y de un modelo (cooperativa) de dos sitios secuencial. A través de la variación de la c-valor como se explicó anteriormente, se estableció que el modelo correcto de unión para AAC (6 ')-II es un modelo de dos sitios de unión secuencial. En este documento, se describen los pasos que se deben tomar cuando se realizan experimentos de ITC para obtener datos adecuados para la variable c-análisis.

Protocolo

1. Preparación de soluciones madre

1. Purificar la macromolécula de interés. (En este caso, aminoglucósidos N-6'-acetil-II (AAC6'-II), se encuentra aislada como se informa en otro lugar. ¹³⁾
2. Preparar 4 litros de tampón de diálisis. (En este caso se utilizó 25 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, 238,3 MW g / mol), que contiene 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 292,2 MW), a pH 7,5.)
3. Dializar la proteína de la AAC (6 ')-II muestra (5 ml a 400 M) deben ser dializados en el tampón de diálisis (3 x 1,3 L). La solución final de diálisis se reduce al lavado de la máquina y para diluir las muestra....

Discusión

Esta porción de análisis de la variable de ajuste-c se ha descrito anteriormente en detalle ^10. Aquí mostramos los aspectos prácticos de la recolección variable c conjuntos de datos adecuados para este enfoque. Es esencial que todas las proteínas y las muestras de ligando se han extraído de las soluciones madre misma. Por lo tanto, es importante que la solución de un stock suficiente se preparó inicialmente para completar toda la serie de experimentos. Esto asegura que la proporción de AAC (6 ')-II y AcCo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetil c–nzima A (AcCoA)	Sigma-Aldrich	A2056
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)	Fisher Scientific	7365-45-9
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Tubo de diálisis Spectra/Por 2	Spectrum Labs	132678
Filtro estéril de jeringa (0.2 μm)	VWR international	281445-477
Filtros de membrana de nitrato de celulosa (0.45 μm)	Whatman, GE Healthcare	7184-004
VP-ITC	MicroCal	VP-ITC	Microcalorímetro utilizado para mediciones
ThermoVac	MicroCal	USB Thermo Vac	Estación de desgasificación controlada por temperatura