La disección y la tinción de Drosophila Larvas Ovarios

Resumen

¿Cómo los nichos y las células madre se forman durante el desarrollo es una cuestión importante con implicaciones prácticas. En el Drosophila, el germen de las células madre de línea y sus nichos somáticos se forman durante el desarrollo larvario. Este video muestra la forma de analizar, las manchas y montaje de las gónadas femeninas a partir de finales del tercer estadio (LL3) Drosophila Larvas.

Resumen

Muchos órganos dependen de las células madre para su desarrollo durante la embriogénesis y para el mantenimiento o la reparación durante la vida adulta. La comprensión de cómo las células madre forman, y cómo interactúan con su medio ambiente es crucial para comprender el desarrollo, la homeostasis y las enfermedades. El ovario de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, ha servido como un influyente modelo para la interacción de las células germinales madre de línea (GSCS) con sus células de apoyo somáticas (nicho) ^{1, 2.} La ubicación conocida del lugar y la GSCS, junto a la capacidad de manipularlos genéticamente, ha permitido a los investigadores para esclarecer una serie de interacciones entre las células madre y sus nichos ^3-12.

A pesar de la gran cantidad de información sobre los mecanismos de control de mantenimiento de la SGC y la diferenciación, se sabe relativamente poco sobre cómo GSCS y sus nichos de forma somática durante el desarrollo. Alrededor de 18 nichos somáticas, cuyos componentes celulares son filamentos de terminales y las células de la tapa (Figura 1), se forman durante el tercer estadio larval ^13-17. GSCS originan de las células germinales primordiales (PGC). PGCs proliferan en las primeras etapas larvales, pero tras la formación del nicho de un subgrupo de PGCs se GSCS ^{7, 16, 18, ​​19.} En conjunto, las células somáticas de nicho y la GSCS hacer una unidad funcional que produce óvulos durante la vida del organismo.

Muchas preguntas sobre la formación de la unidad de GSC permanecen sin respuesta. Procesos tales como la coordinación entre las células precursoras de los nichos y los precursores de células madre, o la generación de la asimetría en PGCs a medida que se GSCS, mejor se pueden estudiar en la larva. Sin embargo, un estudio metódico de desarrollo del ovario larval es un reto físico. En primer lugar, los ovarios de las larvas son pequeñas. Incluso a finales de estadios larvarios son sólo 100μm de diámetro. Además, los ovarios son transparentes y están integrados en un cuerpo de grasa blanca. Aquí se describe un protocolo de paso a paso para el aislamiento de los ovarios de finales del tercer estadio (LL3) larvas de Drosophila, seguido de tinción con anticuerpos fluorescentes. Ofrecemos algunas soluciones técnicas a problemas como la localización de los ovarios, las manchas y el lavado de tejidos que no se hunden, y asegurarse de que los anticuerpos de penetrar en el tejido. Este protocolo se puede aplicar a las primeras etapas de larvas y larvas en los testículos también.

Protocolo

1. La puesta de huevos

1. Cinco días antes de la disección: permitir que las hembras apareadas para poner sus huevos durante 2-4 horas en los alimentos frescos complementado con la levadura. Para obtener larvas sincronizados y bien desarrollado, es importante no tener hacinamiento de cultivo (alrededor de 30 huevos / frasco de 25 mm). Por lo general, las mujeres se utilizan 7.16 por frasco, dependiendo de lo bien que estaba.

2. Selección de las larvas

1. Prepare un plato de cristal de 9 y disección llena con un medio de Ringer (NaCl 128 mm, 2 mm KCl, _CaCl2 1,8 mm, 4 mm de MgCl _2, 35.5mm de sacar....

Discusión

Este vídeo demuestra un aislamiento y el protocolo de tinción de los ovarios a finales del tercer estadio larval. Para llevar a cabo este protocolo de forma rutinaria y segura, se debe prestar atención a los siguientes puntos:

1. Para las larvas sincronizados y bien desarrollado, el hacinamiento se debe evitar.
2. Para evitar la pérdida de los ovarios translúcidos pequeños, asegúrese de analizar la grasa en el cuerpo intacto. Esto también le ayudará en la localización de los ovarios en la etapa de monta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	JT Baker
Kcl	Merck & Co., Inc.
CaCl2	Sigma-Aldrich
MgCl2	Merck & Co., Inc.
Sacarosa	JT Baker
Hepes	Sigma-Aldrich
PBS	Sigma-Aldrich
Triton X-100	Sigma-Aldrich
Albúmina bovina fracción V	MP Biomedicals	160069
Pinzas biológicas Dumont 5 dumstar pulidas	Fine Science Tools	11295-10
Soporte de alfileres chapado en níquel	Fine Science Tools	26018-17
Alfileres minutien de acero inoxidable, diámetro 0,1 mm, largo 10 mm	Fine Science Tools	26002-10
Placas de 9 pocillos, 85x100 mm, 22 mm de diámetro exterior x 7 mm de profundidad	Corning	7220-85
Micrós­copio estereoscópico MZ 16.5 con base estándar de luz transmitida TL ST	Leica Microsystems
Placas de 6 pocillos	Costar	3516
Portaobjetos	Menzel-Glaser	798
Cubreobjetos	Corning	2940-223
Medio de montaje	Vectashield	H-1200
Filtro celular	Falcon BD	FAL352350
Anticuerpo 1B1	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo
Anti-Traffic Jam	Laboratorio del Dr. Dorothea Godt
Anti-Vasa	Laboratorio de la Dra. Ruth Lehmann
Anti-β-Galactosidasa	Cappel
Anticuerpos secundarios	Jackson ImmunoResearch