Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.
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Artículo de método
Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Imágenes es una técnica valiosa que puede ser usado para monitorear los procesos biológicos. En particular, la presencia de células cancerosas, las células madre, los tipos específicos de células inmunes, los patógenos virales, parásitos y bacterias se pueden seguir en tiempo real en que viven los animales 1-2. Aplicación de imágenes de bioluminiscencia para el estudio de patógenos tiene ventajas en comparación con las estrategias convencionales para el análisis de las infecciones en modelos animales 3-4. Las infecciones pueden ser visualizados en animales individuales a través del tiempo, sin necesidad de la eutanasia para determinar la ubicación y la cantidad del patógeno. Imagen óptica que permite la evaluación integral de todos los tejidos y órganos, en lugar de muestreo de los sitios previamente sabe que están infectados. Además, la exactitud de la inoculación en tejidos específicos puede determinarse directamente antes de llevar adelante los animales que fueron inoculados sin éxito durante todo el experimento. Variabilidad entre animales puede ser controlada, ya que permite imágenes de cada animal que han de seguirse por separado. Imágenes tiene el potencial de reducir considerablemente el número de animales necesarios debido a la capacidad de obtener datos de los puntos de tiempo sin tener que numerosas muestras de tejidos para determinar la carga de patógenos 4.3.
Este protocolo describe los métodos para visualizar las infecciones en los animales vivos con imágenes de bioluminiscencia de las cepas recombinantes de bacterias que expresan luciferasa. El escarabajo clic (CBRLuc) y luciferasas luciérnaga (FFluc) utilizan como sustrato luciferina 5-6. La luz producida por las dos CBRluc y FFluc tiene una longitud de onda amplia de 500 nm a 700 nm, por lo que esos reporteros luciferasas excelente para la obtención de imágenes ópticas en modelos animales vivos 7.9. Esto es principalmente porque las longitudes de onda de la luz superior a 600 nm se requieren para evitar la absorción por la hemoglobina y, por tanto, viajar a través de tejidos de mamíferos de manera eficiente. Luciferasa es genéticamente introducido en la bacteria para producir la señal de la luz 10. Los ratones son inoculados con la bacteria pulmonar bioluminiscentes intratraqueal para permitir el monitoreo de las infecciones en tiempo real. Después de la inyección luciferina, las imágenes se adquieren mediante el sistema de imágenes IVIS. Durante estas pruebas, los ratones son anestesiados con isoflurano con una XGI-8 Sistema de Gas Anethesia. Las imágenes pueden ser analizadas para localizar y cuantificar la fuente de señal, lo que representa el sitio de la infección bacteriana (s) y el número, respectivamente. Después de la filmación, la determinación de UFC se lleva a cabo en el tejido homogeneizado para confirmar la presencia de bacterias. Varias dosis de bacterias se utilizan para correlacionar el número de bacterias con luminiscencia. Imagen se puede aplicar al estudio de la patogénesis y la evaluación de la eficacia de los compuestos antibacterianos y vacunas.
Protocolo
1. La infección pulmonar por la intubación intratraqueal
- Pesar los ratones y, opcionalmente, se pueden hacer marcas en las orejas para una fácil identificación.
- Anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg por g de peso del ratón) y xilazina (10 mg por gramo de peso del ratón) mediante la inoculación intraperitoneal.
- Ratones a cabo en jaulas hasta que esté completamente anestesiado. Apriete las almohadillas de sus patas para revisar pedal reflejo. Los ratones deben mostrar reducido o sin reacción refleja.
- Coloque el ratón en el stand de la intubación acostado sobre su espalda.
- Fijar una banda de goma para la intubac....
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Discusión
Aunque después de estos protocolos por lo general resultan en imágenes de alta calidad, es importante tener en cuenta algunas cuestiones clave con el fin de obtener datos precisos y consistentes de los estudios de imagen. Imágenes de luminiscencia se deben adquirir que cuenta con entre 600 y 60.000 para asegurar que la señal está por encima de fondo y la cámara no está saturado. Si la señal obtenida es inferior a 600 las condiciones de exposición debe ser ajustada para aumentar el recuento. Si la señal obtenida es de má.......
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Divulgaciones
Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Texas A & M University.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros Cirillo laboratorio valiosa para los debates y la asistencia a lo largo de este estudio. Agradecemos al Dr. Joshua Hill y el laboratorio del doctor James Samuel para obtener ayuda con durante el rodaje de este protocolo. Este trabajo fue financiado por la beca 48523 de la Fundación Bill & Melinda Gates Foundation y AI47866 beca de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Isoflurano | VETONE | 501027 | |
| Ketamina | Butler Animal Health Supply | ||
| Xilacina | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferina | GMT | LUCK-100 | |
| Solución Fetal Plus | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Catéter (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guía de alambre | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocopo con espéculo | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Sistema Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | ||
| Sistema de anestesia gaseosa XGI-8 | Caliper Life Sciences | ||
| Software Living Imaging | Caliper Life Sciences | ||
| Conos nasales transparentes | Caliper Life Sciences | ||
| Divisor atenuador de luz | Caliper Life Sciences |
Referencias
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
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Reimpresiones y permisos
