La aplicabilidad del ensayo para evaluar la viabilidad clonigénicas reproductiva se ha establecido desde hace más de 50 años. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con células adherentes.
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Artículo de método
Ensayo clonigénicas: las células adherentes
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Resumen
Resumen
El clonigénicas (o formadoras de colonias) de ensayo se ha establecido desde hace más de 50 años, el documento original que describe la técnica se publicó en 1956 1. Aparte de la documentación del método, el estudio de referencia inicial generó la primera dosis de radiación curva de respuesta de rayos X irradiados mamíferos (HeLa) las células en cultivo 1. Básicamente, el ensayo clonogénico permite una evaluación de las diferencias en la viabilidad de la reproducción (la capacidad de las células para producir descendencia, es decir, una sola célula para formar una colonia de 50 o más células) entre las células control no tratadas y las células que han sido sometidos a diversos tratamientos, como la exposición a las radiaciones ionizantes, diversos compuestos químicos (por ejemplo, agentes citotóxicos) o en otros casos la manipulación genética. El ensayo se ha convertido en la técnica más ampliamente aceptada en biología de la radiación y ha sido ampliamente utilizada para evaluar la sensibilidad a la radiación de las diferentes líneas celulares. Además, el ensayo clonogénico se utiliza comúnmente para controlar la eficacia de los compuestos de la radiación y la modificación para determinar los efectos de los agentes citotóxicos y otras terapias contra el cáncer en la capacidad de formación de colonias, en diferentes líneas celulares. Un típico experimento clonigénicas supervivencia utilizando líneas de células adherentes consta de tres componentes distintos: 1) el tratamiento de la monocapa celular en frascos de cultivo de tejidos, 2) la preparación de suspensiones de células individuales y las planchas de un número adecuado de células en placas de Petri y 3) la fijación y la tinción de las colonias después de un período de incubación correspondiente, que podría oscilar entre 1-3 semanas, dependiendo de la línea celular. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con líneas de células adherentes con el uso de un inmortalizado línea celular humana de queratinocitos (FEP-1811) 2. Además, nuestros objetivos son describir las características comunes de los ensayos clonogénicos incluyendo el cálculo de la eficiencia de plaqueo y las fracciones de la supervivencia después de la exposición de las células a la radiación, y para ejemplificar la modificación de la radiación de respuesta con el uso de una formulación antioxidante natural.
Protocolo
1. Cultivo de células y experimental puesta en marcha
- Queratinocitos humanos se mantienen como monocapas en 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 15 ml de queratinocitos-SFM (K-SFM) (GIBCO, medio libre de suero), complementado con L-glutamina (2 mM), factor de crecimiento epidérmico (5 ng / mL), extracto de pituitaria bovina (40 pg / ml) y gentamicina 20 mg / ml. Las células se cultivan en un humidificado 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C.
- Se siembran las células en 12 x 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 5 ml de K-SFM medio.
Suspensiones de célu....
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Discusión
En este ejemplo humano FEP-1811 queratinocitos fueron tratadas con diferentes concentraciones de hasta 100 mg / mL ACB, se muestran los datos de 20 mg / ml ACB durante 1 hora a 37 ° C. Después de celdas de tratamiento fueron irradiados con 4 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para los tratamientos de control no tratado sólo de drogas y 100 células fueron sembradas en cada placa de Petri y 1000 células por placa se colocaron pa.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). HR es apoyado por un australiano de post-grado y premios BakerIDI brillante chispa. Este trabajo está financiado por el CRC de Imágenes Biomédicas Development Ltd (CRC-BID), creado y apoyado en cooperación del gobierno australiano de investigación del programa de Centros. CO es el receptor de un australiano de post-grado de premios y una beca complementaria CRC-BID.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Medio libre de suero para queratinocitos | Medio de crecimiento | Invitrogen | 17005042 | Suplementado con 2 mM de L-glutamina, 20μg/ml de gentamicina, factor de crecimiento epidérmico y extracto de hipófisis bovina. |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Tripsina al 0,05 % / EDTA para desprender células adherentes; stock 10x diluido en PBS sin Ca2+/Mg2+. | |
| Medio esencial modificado de Dulbecco’s | Medio de crecimiento | Invitrogen | 11885-084 | Suplementado con 10 % de SFB y 20μg/ml de gentamicina; utilizado para neutralizar la tripsina/EDTA. |
| Solución salina al 0,09 % | Solución | Utilizada para lavar colonias. | ||
| Solución de formalina tamponada neutra al 10 % | Solución | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4 % de formaldehído; utilizada para fijar colonias. |
| Violeta de cristal | Polvo | SPI Supplies | 02577-MB | Solución al 0,01 % de violeta de cristal, preparada en dH2O, utilizada para teñir colonias. |
| Iradiador Gammacell 1000 elite | Nordion International Inc. | |||
| Placas de Petri | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Hemocitómetro | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Caja de clonación | Caja de plástico con orificios perforados en lados opuestos de la tapa; para almacenar placas de Petri durante la incubación prolongada para la formación de colonias. | |||
| Stereo microscopio | Tipo 102 | Nikon Instruments | Utilizado para contar colonias compuestas por >50 células. |
Referencias
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88,....
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Reimpresiones y permisos
