Ensayo clonigénicas: las células adherentes

Resumen

La aplicabilidad del ensayo para evaluar la viabilidad clonigénicas reproductiva se ha establecido desde hace más de 50 años. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con células adherentes.

Resumen

El clonigénicas (o formadoras de colonias) de ensayo se ha establecido desde hace más de 50 años, el documento original que describe la técnica se publicó en 1956 ^1. Aparte de la documentación del método, el estudio de referencia inicial generó la primera dosis de radiación curva de respuesta de rayos X irradiados mamíferos (HeLa) las células en cultivo ^1. Básicamente, el ensayo clonogénico permite una evaluación de las diferencias en la viabilidad de la reproducción (la capacidad de las células para producir descendencia, es decir, una sola célula para formar una colonia de 50 o más células) entre las células control no tratadas y las células que han sido sometidos a diversos tratamientos, como la exposición a las radiaciones ionizantes, diversos compuestos químicos (por ejemplo, agentes citotóxicos) o en otros casos la manipulación genética. El ensayo se ha convertido en la técnica más ampliamente aceptada en biología de la radiación y ha sido ampliamente utilizada para evaluar la sensibilidad a la radiación de las diferentes líneas celulares. Además, el ensayo clonogénico se utiliza comúnmente para controlar la eficacia de los compuestos de la radiación y la modificación para determinar los efectos de los agentes citotóxicos y otras terapias contra el cáncer en la capacidad de formación de colonias, en diferentes líneas celulares. Un típico experimento clonigénicas supervivencia utilizando líneas de células adherentes consta de tres componentes distintos: 1) el tratamiento de la monocapa celular en frascos de cultivo de tejidos, 2) la preparación de suspensiones de células individuales y las planchas de un número adecuado de células en placas de Petri y 3) la fijación y la tinción de las colonias después de un período de incubación correspondiente, que podría oscilar entre 1-3 semanas, dependiendo de la línea celular. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con líneas de células adherentes con el uso de un inmortalizado línea celular humana de queratinocitos (FEP-1811) ^2. Además, nuestros objetivos son describir las características comunes de los ensayos clonogénicos incluyendo el cálculo de la eficiencia de plaqueo y las fracciones de la supervivencia después de la exposición de las células a la radiación, y para ejemplificar la modificación de la radiación de respuesta con el uso de una formulación antioxidante natural.

Protocolo

1. Cultivo de células y experimental puesta en marcha

1. Queratinocitos humanos se mantienen como monocapas en 75 cm ² frascos de cultivo de tejidos que contienen 15 ml de queratinocitos-SFM (K-SFM) (GIBCO, medio libre de suero), complementado con L-glutamina (2 mM), factor de crecimiento epidérmico (5 ng / mL), extracto de pituitaria bovina (40 pg / ml) y gentamicina 20 mg / ml. Las células se cultivan en un humidificado _5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C.
2. Se siembran las células en 12 x 25 cm ² frascos de cultivo de tejidos que contienen 5 ml de K-SFM medio.

Suspensiones de célu....

Discusión

En este ejemplo humano FEP-1811 queratinocitos fueron tratadas con diferentes concentraciones de hasta 100 mg / mL ACB, se muestran los datos de 20 mg / ml ACB durante 1 hora a 37 ° C. Después de celdas de tratamiento fueron irradiados con 4 Gy utilizando una fuente de ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para los tratamientos de control no tratado sólo de drogas y 100 células fueron sembradas en cada placa de Petri y 1000 células por placa se colocaron pa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio libre de queratinocitos Medio libre de suero	Medio de crecimiento	Invitrogen	17005042	Suplementado con 2 mM de L-glutamina, 20μ g/ml de gentamicina, factor de crecimiento epidérmico, extracto de hipófisis bovina.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% tripsina / EDTA para separar las células adherentes; 10 x stock diluido en PBS sin Ca2+/Mg2+.
Dulbecco' s medio esencial modificado	Medio de crecimiento	Invitrogen	11885-084	Suplementado con 10% FBS y 20μ g/ml de gentamicina; utilizado para neutralizar la tripsina/EDTA.
0.09%	Solución salina			Se utiliza para lavar colonias.
10% Solución de formalina tamponada neutra	Solución	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehído; utilizado para fijar colonias.
Polvo de violeta cristalina		SPI Supplies	02577-MB Solución de	violeta cristalina al 0,01%, preparada en dH2O, utilizada para teñir colonias.
Irradiador Gammacell 1000 elite	Nordion International Inc.
Placas de Petri	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Hemocitómetro		Hawksley; Equipo médico y de laboratorio	AC1000
			de clonación	Caja de plástico con agujeros perforados en los lados opuestos de la tapa; para almacenar placas de Petri durante la incubación prolongada para la formación de colonias.
Microscopio estereoscópico	Tipo 102	Instrumentos		Se utiliza para contar colonias que constan de > 50 celdas.