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1. Cultivo de células y experimental puesta en marcha
- Queratinocitos humanos se mantienen como monocapas en 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 15 ml de queratinocitos-SFM (K-SFM) (GIBCO, medio libre de suero), complementado con L-glutamina (2 mM), factor de crecimiento epidérmico (5 ng / mL), extracto de pituitaria bovina (40 pg / ml) y gentamicina 20 mg / ml. Las células se cultivan en un humidificado 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C.
- Se siembran las células en 12 x 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 5 ml de K-SFM medio.
Suspensiones de células individuales son preparadas por tripsinización. Las células se lavan con tampón fosfato salino y se incubaron con un 0,05% de tripsina / EDTA durante 5-10 minutos. Cuando las células empiezan a ser redondeados y aproximadamente el 30% son separados, 3 volúmenes de Dulbecco modificado medio de Eagle con 10% de suero fetal bovino se agrega para neutralizar la tripsina. Las células se separan por pipeteando arriba y abajo (20 veces). Las células se contaron usando un hemocitómetro.
Un número adecuado de células son clasificados de acuerdo con el tiempo de duplicación de la línea celular (aproximadamente 20 horas para el consumo humano FEP-1811 queratinocitos). El objetivo es lograr la confluencia de ~ 90% (~ 10 6 células por frasco) en el día del experimento.
Un experimento que consta de 12 frascos es óptimo para un solo ensayo clonogénico (seis de control no irradiados y seis frascos irradiados) que puede ser completado en aproximadamente cuatro horas.
2. El tratamiento y la irradiación
- Tratamiento de las células durante el tiempo necesario con una relevante modificación de la radiación compuesto y exponer las células a las radiaciones ionizantes o γ-radiación o radiografías.
Por lo general seis frascos servir como eficiencia de plaqueo (sin tratamiento) y los controles de drogas solamente. Los otros seis frascos son irradiados.
En este ejemplo, los queratinocitos humanos son tratados con distintas concentraciones de Cinnulin PF (CPF; Nutracéuticos Internacional de Integridad, Spring Hill, TN, EE.UU., los datos representativos de 20 mg / ml se muestra a continuación), soluble en agua formulación antioxidante natural, durante 1 hora a 37 ° C. Las células son irradiadas con 4 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min).
3. Enchapado
- Después del tratamiento, suspensiones de células individuales se obtienen como se describió anteriormente.
- El número de células en cada muestra se contó con cuidado utilizando un hemocitómetro y se diluye de tal manera que el número de células apropiadas se siembran en placas de Petri (cinco réplicas de cada uno en 15 mm platos).
Las planchas de eficiencia y / o sobrevivientes fracción debe preverse la hora de decidir el número de células a las semillas por placa. El objetivo es alcanzar un rango de entre 20 a 150 colonias. Placas de Petri están dispuestos en una caja de plástico de la clonación humidificado y se incubaron en un 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C para la formación de colonias.
El tiempo de incubación para la formación de colonias varía de 1-3 semanas para las líneas celulares diferentes, se acepta que el tiempo debe ser equivalente a por lo menos seis divisiones celulares. En este ejemplo, los platos de control de los queratinocitos humanos requieren ocho días para formar clones lo suficientemente grande que consta de 50 o más células.
4. Fijación y tinción de las colonias
Complete los siguientes pasos en una campana extractora.
- Retire con cuidado los medios de comunicación de cada una de las placas por aspiración.
- Lave cada placa con 5 ml de solución salina al 0,9%.
- Fijar las colonias con 5 ml de 10% neutral solución de formalina tamponada durante 15-30 minutos.
- Mancha con 5 ml 0,01% (w / v) de cristal violeta en dH 2 O durante 30-60 minutos.
- Lavar el exceso de cristal violeta con dH 2 O y deje que los platos se sequen.
5. Recuento de colonias
Estereomicroscopio
- Las colonias que contienen más de 50 células individuales se cuentan utilizando un microscopio estereoscópico.
La imagen digital y contar con software de imágenes
- Las imágenes digitales de las colonias se han obtenido utilizando una cámara o un dispositivo de escaneo
- Se cuentan las colonias utilizando imágenes de los paquetes de software de análisis como se describe a continuación.
Conteo de células con ImageJ (Fiji Versión 1.44a)
- Abra el archivo de imagen en Fiji, vaya a Archivo -> Abrir.
- Si es necesario convertir la imagen en formato de 8 bits, vaya a Imagen -> Ajustar umbral ...->.
- Ajuste de umbral para reducir los niveles de fondo no específica de manera que sólo las colonias se detectan.
- Contar las colonias con lo siguiente: Ir al proceso - binario> -> Buscar máximos.
Para este formato de imagen, la tolerancia al ruido puede ser ajustado a 0. Asegúrese de que la opción de fondo claro está marcada y vista previa de la máxima detectada para comprobar que todas las colonias de células se han registrado correctamente.