Drosophila melanogaster testículos puede ser rápida y eficazmente aisladas de los machos adultos el uso de agujas de disección. Con la práctica, uno puede fácilmente aislado en uno o dos días una cantidad de testículos suficiente para el análisis de ADN o ARN mediante la secuenciación de alto rendimiento o los métodos moleculares más tradicionales de biología o de la proteína para los ensayos de anticuerpos o enzimas base.
Artículo de método
El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los testículos de Drosophila melanogaster proporcionar un importante modelo para el estudio de mantenimiento de las células madre y la diferenciación, la meiosis, y las interacciones soma-la línea germinal. Los testículos están generalmente aisladas de los machos adultos 0-3 días después de la eclosión de la envoltura pupal. Los testículos de moscas de tipo silvestre se distinguen fácilmente de otros tejidos, ya que son de color amarillo, pero los testículos de los blancos moscas mutantes, un fondo genético común para los experimentos de laboratorio son similares en forma y color a la tripa volar. Realizar la disección en un portaobjetos de vidrio con un fondo negro hace que la identificación de los testículos mucho más fácil. Los testículos son removidos de las moscas usando agujas de disección. En comparación con los protocolos que utilizan pinzas de disección de los testículos, nuestro método es mucho más rápido, permitiendo que una persona bien practicado para diseccionar testículos 200 a 300 de tipo salvaje moscas por hora, produciendo 400-600 testículos. Los testículos de la mosca blanca o de mutantes que reducir el tamaño de los testículos son más difíciles de diseccionar y generalmente producen los testículos 200-400 por hora.
Protocolo
- Hacer un portaobjetos de vidrio con un fondo negro: Corte papel de 20 # blanco del mismo tamaño que el portaobjetos del microscopio. Color de un lado del papel negro de diapositivas de tamaño usando un marcador permanente (por ejemplo, Sharpie). Aplique pegamento blanco (Elmer) para el lado negro y adherir el papel a la diapositiva. La diapositiva puede ser reutilizado. El uso de ¾ "cinta de etiquetas (Fisherbrand), asegure el portaobjetos de microscopio, laterales de vidrio arriba, a la plataforma de CO 2 a volar fijarlo en su lugar.
- Recoger 0-3 días de edad moscas macho.
- Preparar un cubo de hielo, tampón fosfato salino (PBS), agujas de disección.
- Anestesiar a las moscas de 50-100 con una corriente de CO 2 y transferirlos de la botella o frasco a la plataforma de vuelo cerca del portaobjetos de microscopio.
- Pipeta ~ 50 l helado de PBS en una gota en el centro de la diapositiva del microscopio.
- Suavemente recoger una mosca macho con la disección de la aguja por inmersión en la aguja de disección en PBS, suave toque la cara ventral (es decir, cerca de las alas) de la mosca con la aguja es el lugar dentro de la gota de PBS.
- Coloque una aguja en el centro de la marcha, entre el tórax y el abdomen, empujando hacia abajo con firmeza. Coloque la otra aguja entre la sexta (A6) y séptima (A7) segmentos abdominales (las rayas de la segunda y tercera de la parte inferior), tirar del abdomen fuera del tórax.
- Se burlan de los testículos, aparte de otros órganos, especialmente el intestino. Especialmente en los mutantes de blanco, los testículos y el intestino son similares. Principales diferencias son que los testículos siempre vienen en pares, cada testículo tiene forma de espiral y es más blanco que el color de intestino.
- Tienda de los testículos en el helado de PBS en un tubo de microcentrífuga de polipropileno.
Los resultados representativos:
Figura 1. Vista dorsal del sistema reproductor masculino, de flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase atribución:... "Después de la Figura 38 A en la página 508 de Miller (1950) A. Miller La anatomía interna y la histología de la imago de Drosophila melanogaster En Demerec M., editor, Biología de la Drosophila, el capítulo 6, páginas 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edición facsímil, 1994. Copyright 1994 por Cold Spring Harbor Laboratory Press. Usado con permiso de Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press. Ver http://www.cshlpress.com ".
Discusión
Ofrecemos un protocolo para aislar a los testículos de hombres adultos Drosophila melanogaster. Debido a que la técnica requiere la coordinación de una de las dos manos, la habilidad sólo se logra con la práctica.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Vasia Vagin para la introducción de esta técnica en nuestro laboratorio.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Aguja de disección | Herramienta | Fisher Scientific | S17346 | |
| Portaobjetos microscópicos, lisos | Herramienta | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Luz para microscopio | Herramienta | Schott AG | KO-1500 | |
| Almohadilla de CO2 | Herramienta | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Sistema completo Benchtop Flowbuddy | Herramienta | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Humedecedor con burbujas | Herramienta | Salter Labs | 7100 | |
| Aguja para llenado con bola | Herramienta | Genesee Scientific | 54-119 | |
| Cinta etiquetadora ¾” | Suministro | Fisher Scientific | 15-901-5B |
Referencias
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
Reimpresiones y permisos
