免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Summary

メソッドは、マウスにヒトの網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するために記述されています。腫瘍細胞は、直接免疫欠損マウスの眼に注入されています。二次腫瘍が正常に直接ヒト腫瘍および培養tumorspheresから採取した細胞の両方を使用して確立されている。

Abstract

定義された幹細胞培地で培養網膜芽細胞腫の腫瘍細胞は、限られた時間のために栽培し、維持することができる主tumorspheresを生じさせる。元の腫瘍と比較すると、これらの培養tumorspheresは著しく異なる細胞の表現型を示すことができる。培養細胞は、新しい腫瘍を形成する能力を持っているデモは、その培養細胞モデルを元の腫瘍の生物学を確保することが重要です。

^{/ - -}免疫欠損マウスここではRAG2を用いた in vivo でのヒト網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するためのプロトコルを提示する。低継代またはマウスの眼の硝子体腔内に直接注入されたばかりの収穫、人間の網膜芽細胞腫の腫瘍から得られた細胞の培養ヒト網膜芽細胞腫のtumorspheresは2-4週間以内に腫瘍を形成する。これらの腫瘍を採取し、どちらさらにin vivoでのマウスの目に継代またはin vitroで tumorspheresとして成長させることができる。伝播が正常に少なくとも三つの通路ため、さらに実験のための人間の網膜芽細胞腫の組織の継続的なソースを確立するために行われている。

ウェズリーS.ボンドとLalita Wadhwaは、共同最初の著者です。

Protocol

1。網膜芽細胞腫のtumorspheresの準備

1. IRB承認されたプロトコルの下で網膜芽細胞腫の腫瘍のサンプルを入手。
2. 新鮮定義されている幹細胞のメディアを準備する（Neurobasal -メディア、1X B - 27サプリメントマイナスビタミンA、1X非必須アミノ酸溶液、1X L -グルタミン、20 ng / mLのEGF、10 ng / mlのbFGFを）。
3. 機械的に滅菌、組織培養処理した6穴プレートの横断的な技法を用いてメスで腫瘍組織を分解。すぐに組織に定義された幹細胞の培地を100μLを加え、穏やかにメスを使用してみじん切りの組織を広げる。ウェルに定義された幹細胞の培地を5mLを追加。
4. 37℃でインキュベートする加湿インキュベーター中、C、5％CO ₂と日常点検。いくつかtumorspheresは2-4日の経過とともに増えて、ほとんどすぐに中断腫瘍組織から発生するはず。
5. 毎週、5分間300xgで遠心tumorspheresは、作りたての定義幹細胞の培地に再懸濁し、そしてピペット上下10倍は大きく、集中的に壊死球を破壊し、新しい、健康的な球体を形成できるようにする。

2。注射のための腫瘍細胞の調製

1. 15 mLコニカルチューブに静かに培養tumorspheres、ピペットの球を注入する場合。血清学的ピペットでアップダウン優しくピペット球を混乱に10-15回。
2. 新しいチューブに注入ごとに少なくとも50,000個の細胞を細胞は血球計算盤を用いて注入されるようにカウントし、分注し。使用可能なセルの数に基づいて、できるだけ多くの注射の準備。
3. 5分間300xgで遠心分離します。注意深く5mLのPBSで上清と再懸濁しますを吸引除去する。遠心分離や吸引を繰り返し、インジェクションあたり10μLのPBSに再懸濁します。

3。動物の準備

1. インスリンの注射器を用いて、グラム体重あたり1μL（GBW）でげっ歯類の麻酔のカクテルの腹腔内注射（ケタミン37.6 mg / mLの、キシラジン1.92 mg / mLの、アセプロマジン0.38 mg / mL）を管理する。鎮静になるために動物のための5分間待ちます。ハートビートをチェックし、加熱されたパッドの上に動物を置く。回復されるまで常に加熱パッド上に動物を維持する。
2. 鎮静した後、右眼にプロパラカイン塩酸1滴を管理する。加熱されたパッドの上に動物を交換し、1分間待ちます。
3. 右目にフェニレフリン塩酸1滴を管理する。加熱されたパッドの上に動物を交換し、5分間待ちます。瞳孔の散大が発生していない場合、1滴を再投与し、さらに5分待って。
4. > 30分後に鎮静剤で発生する可能性のある運動やけいれんの兆候、動物を監視する。運動の最初の兆候で、ケタミン塩酸（PBS中10 mg / mlに希釈）の1μL/ GBWを管理し、5分間待ちます。

4。腫瘍細胞の注入

1. 右眼を上に向けて、ガーゼで休む頭部と、その側に顕微鏡下で麻酔した動物を置き、顕微鏡で観察するときに右眼眼底（瞳がこの時に瞳孔が開いする必要がある）の赤色の反射を得るために中心。
2. 軽くまぶたに二本指で同時に押し下げ、手順の残りのために着実にこの位置を保持することによって右の地球を支える。
3. ピアス地球儀は、毛様扁平の面積（図1）で、ちょうど硝子体腔に脈絡膜を介して角膜輪部に隣接する結膜と強膜を介して横方向に、ルアーロックシリンジに接続されている滅菌30ゲージの針を使用する。開口部から針を外します。
4. アルコール綿棒でハミルトンの針を滅菌する。ハミルトンシリンジに細胞懸濁液を描画し、針が網膜の近くに硝子のレンズの後ろに顕微鏡で視覚化されるまで、開口部に針を挿入する。このポジションで着実に針を押しながらもう一人の助けを借りて、プランジャーをゆっくり押し下げます。ニードルを取り外します。必要に応じて、開口部から任意の流体を吸収するために綿棒を使用してください。
5. ゆっくりとマウスのまぶたを閉じてまぶたの圧力を解放。
6. それぞれの目にヒプロメロースの1滴を投与し、回復のための加熱パッドに動物を返します。

5。注射したマウスと腫瘍の収穫のモニタリング

1. 毎日、通常2〜4週間の注射後に明らかになると、注入白色瞳孔のための目（白乳頭反射）および/または眼周囲の膨満を調べます。
2. 腫瘍の増殖が検出されると、制度的なガイドラインに従って動物を安楽死させる。
3. 目と腫瘍がまぶたで覆われている場合、眼瞼裂の直交する二切開を行い、皮膚フラップを持ち上げるためにメスを使用してください。
4. 実体顕微鏡を用いて可視化の下に、角膜と水晶体を除去し、角膜輪部に周方向の切開を行い、慎重に取り澄ましたを使用して他の組織から腫瘍の質量の大部分を細かく分析zers。無菌RPMI - 1640培地で腫瘍を置きます。
5. ゆっくりとソケットから開いて世界を引っ張ってピンセットを使用してください。腫瘍の浸潤を可視化できるように接続された視神経を確保するために、神経が露出するまで地球を引き出し、できるだけ長く神経を切断するはさみを使用してください。組織学的検査のための定期的な処理のために10％ホルマリンに置きます。

6。代表的な結果：

網膜芽細胞腫のtumorspheresはほとんどすぐに彼らは、腫瘍塊から解放として分解された組織から表示されるようになります。 2〜4日以内に、より多くのtumorspheresが形成するとサイズが増加するが開始されます。球は、通常のものと集約（図2）周囲の明確に定義された、二次膜を示す傾向がある。

動物は通常、腫瘍が大きくなるにつれて（図3c）5-8週間注射後に周囲の組織の世界と膨張の拡大が続く、4週間後の注入（図3b）内に白色瞳孔を呈する。

図1。プロトコルで参照されている機能に焦点をマウスの眼の断面図。

図2 in vitroでのヒト網膜芽細胞腫細胞の培養）は4倍で撮像、 およびb）10倍対物レンズ倍率。網膜芽細胞腫、原発腫瘍の細胞は規則的な回転楕円体の形状とさわやかな外膜とtumorspheresを生成する。スケールバーは）500μmを表し、a とb）は200μm。

図3 RAG2のアイ- / - 、B）を通常の機能を示すマウス）硝子体腔内の腫瘤を示す白色瞳孔、 およびc）大規模な腫瘍塊は、関連する眼周囲の膨満感、眼内出血で地球儀を充填。

Discussion

ここに記載された技術は、彼らの眼内、硝子体内環境での伝搬の網膜芽細胞腫の腫瘍を促進する。眼内注射の技術は、網膜芽細胞腫由来細胞株¹と同様に眼遺伝子治療^2,3のためのウイルスベクターを提供するから腫瘍を作成するために、過去に使用されています。この手法は、これで正常に原発腫瘍と注射tumorspheresのだけでなく、異種移植片腫瘍のシリアル伝播から細胞を直接注入することにより、人間の網膜芽細胞腫の腫瘍を生成するために利用されている。腫瘍形成（通常は白色瞳孔）の目に見える証拠は、通常、最初に軌道を取り巻く世界および/または組織の眼内出血や膨満5〜8週間以内に開発した後、4週間以内に記載されています。注射されたマウスの少数派は、まぶたの永久閉鎖につながる、充血した目を傷つける。これらのケースでは、膨満は、腫瘍形成の唯一の徴候である。

確立された異種移植腫瘍の増殖が非常に成功した場合もマウス異種移植腫瘍の確立は、すべての人間の網膜芽細胞腫の腫瘍を持つ成功していない。この観察は、そのような差別やその他の未知の要因の侵襲性やレベルなどの原発腫瘍の特定の特性が、、マウス眼球の環境中に残留するためにこれらの腫瘍の能力に影響を与える可能性がありますことを示唆している。

人間の網膜芽細胞腫の腫瘍から取得することができる組織の量はかなり小さいです、そしてそのような限られた寿命、固形腫瘍の組織像の消失と細胞の表現型の変化として、 体外培養ヒト網膜芽細胞腫の細胞への能力に大きな制限があります。このプロトコルは、ヒトの腫瘍を伝播し、ヒト疾患のマウスモデルを確立するために比較的単純な方法を提供します。これは、in vitroおよび網膜芽細胞腫と患者の腫瘍外の長いメンテナンスの生物の in vivo実験におけるさらなるできます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenylephrine HCl 2.5%	Bausch and Lomb	053-11	Ophthalmic solution
30-ga Needle	BD Biosciences	305128	Regular bevel
10-mL Luer-Lock Syringe	BD Biosciences	309604
3/10-cc Insulin Syringe	BD Biosciences	328431
Alcohol swabs	BD Biosciences	326895
6-Well Plate, Tissue Culture-Treated	BD Biosciences	353046
Proparacaine HCl 0.5%	Butler Animal Health Supply	017239	Ophthalmic solution
Ketamine HCl 100mg/mL	Fort Dodge Animal Health	4402A
10-μL Hamilton Syringe	Hamilton Co	7648-01
32-ga Hamilton Needle	Hamilton Co	7803-04	Custom length - 0.5"
Neurobasal-A Media	Invitrogen	10888-022
B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X	Invitrogen	12587-010
RPMI-1640 Media	Mediatech, Inc.	10-040-CV
Non-essential Amino Acid Solution, 100X	Mediatech, Inc.	25-025-CI
L-Glutamine, 100X	Mediatech, Inc.	25-005-CI
Disposable #11 Scalpel	Miltex Inc.	4-411
Rodent Anesthesia Combo	N/A	n/a	In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL)
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Stem Cell Technologies	02633	Reconstitute at 10 μg/mL stock solution
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Stem Cell Technologies	02634	Reconstitute at 10 μg/mL stock solution
OMS-75 Operation Microscope	Topcon Medical Systems	OMS-75	This model has been discontinued
10% Formalin	VWR international	95042-908