La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Resumen

La unión neuromuscular (UNM) de Drosophila melanogaster Es un importante sistema modelo para estudiar la función sináptica normal, así como las perturbaciones de la función sináptica en ciertas enfermedades neurológicas. Se presenta un protocolo para la disección de la Drosophila Larval del sistema motor y la inmunotinción de proteínas de la zona activa dentro de la UNM.

Resumen

La Drosophila larvas de la unión neuromuscular (UNM) es un excelente modelo para el estudio de la estructura y la función sináptica. Drosophila es bien conocido por la facilidad de manipulación genética de gran alcance y el sistema nervioso de larvas ha demostrado ser particularmente útil para estudiar no sólo la función normal, sino también las perturbaciones que acompañan a algunas enfermedades neurológicas (Lloyd y Taylor, 2010). Muchas moléculas clave sináptica en Drosophila también se encuentran en los mamíferos y como la mayoría de las sinapsis excitadoras del SNC en los mamíferos, la Drosophila NMJ es glutamatérgica y demuestra dependiente de la actividad de remodelación (Koh et al., 2000). Además, las neuronas de Drosophila pueden ser identificados individualmente, porque sus patrones de inervación son estereotipados y repetitivos que permiten al estudio identificó las terminales sinápticas, como las que existen entre las neuronas motoras y las fibras musculares de la pared del cuerpo que inervan (Keshishian y Kim, 2004). La existencia de los componentes de la sinapsis conservado evolutivamente, junto con la facilidad de manipulación genética y física que el modelo de Drosophila ideal para investigar los mecanismos subyacentes a la función sináptica (Budnik, 1996).

Las zonas activas en las terminales sinápticas son de particular interés debido a que estos son los sitios de liberación de neurotransmisores. NC82 es un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína de Drosophila Bruchpilot (BRP), un miembro de la familia CAST1/ERC que es un componente importante de la zona activa (Wagh et al., 2006). BRP ha demostrado que la forma directa de la zona activa T-bar y es responsable de manera efectiva la agrupación Ca ^{2 +} canales por debajo de la densidad de T-bar (Fouquet et al., 2009). Los mutantes de BRP han reducido la densidad de Ca ^{2 +} canal, deprimido liberación evocada vesícula, y la alteración a corto plazo plasticidad (Kittel et al., 2006). Alteraciones en las zonas activas se han observado en modelos de enfermedad de Drosophila. Por ejemplo, la inmunofluorescencia con el anticuerpo NC82 mostraron que la densidad de la zona activa se redujo en los modelos de la esclerosis lateral amiotrófica y el síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Por lo tanto, la evaluación de las zonas activas, o de otras proteínas sinápticas, en los modelos de las larvas de Drosophila de la enfermedad pueden proporcionar una valiosa pista inicial a la presencia de un defecto sináptica.

La preparación de todo el montaje disecados larvas de Drosophila para el análisis de inmunofluorescencia de la UNM requiere cierta habilidad, pero se puede lograr por la mayoría de los científicos con un poco de práctica. Que se presenta es un método que ofrece para las larvas de varios de ser diseccionado y immunostained en el plato de la disección mismo, lo que limita las diferencias ambientales entre cada genotipo y proveer suficientes animales para la confianza en la reproducibilidad y el análisis estadístico.

Protocolo

1. Preparación para la inmunofluorescencia:

1. Para crear una superficie de disección, vierta Sylgard 184 Base de elastómero de silicona en una placa de cultivo de tejidos pequeños. Asegúrese de no llenar completamente la placa para que el área de disección es menor que la llanta.
2. Trim pines disección de una longitud aproximada de 3,5 mm para una mayor facilidad de manipulación, y asegúrese de tener al menos 6 pines por larva.
3. Usted necesitará unas pinzas contundente que le permitirá a usted comprender los pines para la disección.

2. La disección de las larvas:

1. Seleccione vagando larvas de terc....

Discusión

Para las neuronas, la zona de la terminal sináptica es de vital importancia, y es el puente para la correcta comunicación entre el puesto y las células pre-sináptica. Una forma poderosa para investigar la salud de las neuronas en modelos de enfermedad es analizar las proteínas de la terminal sináptica por inmunofluorescencia. El método de inmunofluorescencia que aquí se presenta permite al investigador para examinar las larvas de manera simultánea al tiempo que limita las diferencias ambientales entre los grupos. El sis.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sylgard 184 Base de silicona de elastómero	Dow Corning	68037-59-2	Después de la mezcla permite que las burbujas se elevan lentamente por poner en los rotadores lentos o permitir que repose durante 30 minutos o más.
De acero inoxidable Minutien PIN	Herramientas de Bellas Ciencia	26002-10	Recorte de aprox. 3-4mm de longitud con tijeras regulares
Pinzas laminectomía (Blunt: se utiliza para agarrar pines)	Herramientas de Bellas Ciencia	11223-20	Su uso como pinzas para agarrar contundente pines
Pinzas de disección	Mundial de Instrumentos de Precisión	501985
Vannas Tijeras SuperFine, 8 cm de largo	Mundial de Instrumentos de Precisión	501778
Mouse anti-BRP anticuerpos	DSHB	NC82	Utilice dilución 1:50
Cy3 cabra AffiniPure anti-peroxidasa de rábano	Jackson Immunoresearch	123-165-021	Uso en la dilución 1:200
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG	Invitrogen	A11001	Uso aprox. Dilución 1:200