Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Resumen

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Resumen

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) es una poderosa herramienta para identificar las proteínas: las interacciones de la cromatina que se producen en el contexto de las células vivas ^1-3. Esta técnica ha sido ampliamente explotada en las células de cultivo de tejidos, y en menor medida, en el tejido principal. La aplicación de chip en el tejido embrionario de roedores, especialmente en los momentos iniciales de desarrollo, se complica por la limitada cantidad de tejido y la heterogeneidad de las células y tipos de tejidos en el embrión. Aquí presentamos un método para llevar a cabo mediante un chip el día embrionario disociados 8.5 (E8.5) embrión. Cromatina esquilada de un solo embrión E8.5 se pueden dividir en un máximo de cinco alícuotas, lo que permite que el material suficiente para el investigador y controles para la investigación de proteínas específicas: las interacciones de la cromatina.

Hemos utilizado esta técnica para comenzar a documentar las proteínas: las interacciones de la cromatina durante la especificación de los tejidos específicos de los programas de expresión génica. La heterogeneidad de los tipos de células en un embrión necesariamente restringe la aplicación de esta técnica porque el resultado es la detección de proteínas: las interacciones de la cromatina sin distinguir si las interacciones ocurren en todos, un subconjunto de, o un solo tipo de células (s). Sin embargo, el análisis de genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de la expresión génica es posible por dos razones. En primer lugar, la inmunoprecipitación de los factores específicos de tejido necesariamente aislados de la cromatina del tipo de célula donde se expresa el factor. En segundo lugar, la inmunoprecipitación de coactivadores y las histonas que contiene modificaciones post-traduccionales que se asocian con la activación de genes sólo se encuentran en los genes y secuencias reguladoras de genes en el tipo de células donde el gen está siendo o ha sido activada. La técnica debe ser aplicable al estudio de la mayoría de los tejidos específicos de los eventos de activación genética.

En el ejemplo que se describe a continuación, se utilizó E8.5 y E9.5 embriones de ratón para examinar los factores de unión en un promotor del gen específico del músculo esquelético. Somitas, que son las precursoras de los tejidos que los músculos del esqueleto del tronco y las extremidades se forman, están presentes en E8.5-9,5 ^4,5. Myogenin es un factor de regulación necesarios para la diferenciación del músculo esquelético ^6.9. Los datos demuestran que miogenina se asocia con su propio promotor en E8.5 y E9.5 embriones. Porque miogenina sólo se expresa en somitas en esta etapa de desarrollo ^6,10, los datos indican que las interacciones miogenina con su propio promotor ya se han producido en las células del músculo esquelético precursor en E8.5 embriones.

Protocolo

1. Aislamiento de los embriones

Nota: Todas las operaciones con ratones se debe realizar de acuerdo con el cuidado de los animales y las políticas adecuadas de uso y protocolos

1. Comprobar la presencia de un tapón de apareamiento en los ratones hembra de la mañana después del apareamiento y separar las hembras apareadas de los machos estudios, colocándolos en una jaula diferente. Del mediodía del día en que el tapón de apareamiento que se observa es considerado el día embrionario 0.5 (E0.5) de desarrollo.
2. En E8.5, (o la etapa deseada, si es diferente), el sacrificio del ratón usando un protocolo aprobad....

Discusión

En el protocolo de chip se describe, se muestra que la miogenina regulador miogénico se asocia con el promotor miogenina en el tejido esquelético precursor muscular presente en un solo E8.5 y E9.5 embriones. Estudios anteriores han caracterizado ampliamente miogenina unión a la caja de E que contienen secuencias, comenzando con los primeros experimentos in vitro utilizando gel de cambio traducido in vitro o producidas por bacterias y ADN miogenina radiomarcado que codifica la porción .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo ChIP	Upstate, Millipore	17-295
Colagenasa Tipo II	Invitrogen	17101015	Dilución con PBS 1x
Dulbecco’medio de Eagle modificado (DMEM)	GIBCO, por Life Technologies	12100-061	Alto contenido de glucosa
Dulbecco’s fosfato tamponado salino 1X (DPBS)	GIBCO, por Life Technologies	14190-144	Libre de cloruro de calcio, libre de cloruro de magnesio
Suero bovino fetal (SBF)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Kit de extracción de geles	QIAquick	28704	kit de 50 reacciones
Solución stock de penicilina/estreptomicina	GIBCO, por Life Technologies		5000 μconcentración en g/ml
Cóctel de inhibidores de proteasas	Sigma-Aldrich	P8340
ADN de esperma de salmón/agarosa con proteína A	EMD Millipore	16-157
anticuerpo anti-miogenina	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
IgG de conejo normal	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
mezcla maestra GoTaq Q-PCR	Promega Corp.	A6001