Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Resumen

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Resumen

Las células madre neurales (NSC) residen en la zona ventricular neuroepitelio durante el desarrollo de la placa cortical. Estos primeros progenitores en última instancia, dan lugar a los progenitores intermedios y más tarde, los diferentes subtipos de células neuronales y gliales que forman la corteza cerebral. La capacidad de generar y ampliar NSCs humanos (los llamados neuroesferas) a partir de tejido fetal normal descarta proporciona un medio con el cual estudiar directamente los aspectos funcionales de la normalidad del desarrollo humano NSC ^1.5. Este enfoque también puede ser dirigido hacia la generación de NSCs de trastornos neurológicos conocidos, ello se traduzca en la oportunidad de identificar los procesos de enfermedad que altera la proliferación de progenitores, la migración y la diferenciación de ^6-9. Nos hemos centrado en la identificación de los mecanismos patológicos en humanos NSCs síndrome de Down que pueden contribuir a acelerar el fenotipo de la enfermedad de Alzheimer ^10,11. Ni en vivo ni in vitro modelos de ratón se puede replicar el repertorio idéntico de genes localizados en el cromosoma humano 21.

Aquí se utiliza un método sencillo y fiable para aislar el síndrome de Down NSCs de corteza fetal humano abortado y crecer en cultivo. La metodología ofrece aspectos específicos de la recolección de los tejidos, la disección con puntos de referencia anatómicos limitado, separación celular, placas y pases de NSCs humanos. También proporcionamos algunos protocolos básicos para inducir la diferenciación de las NSCs humanos en subtipos de células más selectivo.

Protocolo

1. Preparación de soluciones y materiales para la disección y el mantenimiento de la cultura de células madre neurales

1. Prepare 100 ml medio de disección (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) antes de tiempo y refrigere.
2. Prepare100 ml medio de cultivo (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) y mantener a 37 ° C en un baño de agua.
3. Prepare la celda del punto de congelación medio (KNOCKOUT DMEM/F12 10% de SFB + 5% de DMSO) para la crioconservación a largo plazo de las células.
4. Si lo desea, prepare un 4% de paraformaldehído (PFA) para la fijación del tejido.
5. Pinzas esterilizadas, autoclave y hojas de bisturí con mango se utiliza para la ....

Discusión

Existen varios enfoques hacia el cultivo de tejidos frescos y la producción de líneas celulares humanas. Históricamente, el tejido fresco ha sido cosechados y cultivados de inmediato para generar diversos tipos de células en el sistema nervioso central. Esta estrategia, sin embargo está claramente limitado por el número de muestras que se pueden obtener, que en el caso de muestras humanas, suele ser bastante pequeña. Teniendo en cuenta el grado mínimo de la manipulación, las células neuronales cultivadas recién dotar al.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
KNOCKOUT DMEM/F12	Invitrogen	12660-012	Disociación medio
Madre Pro NSC SFM	Invitrogen	A10509-01	Medio de cultivo
De suero fetal bovino	Invitrogen	10091-148	Medio congelados
Hanks solución (-Ca 2 +, Mg 2 +)	Invitrogen	14175-095	Disociación medio
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Medio congelados
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	Disociación medio
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	158127	La fijación de una solución
bFGF	I + D	234-FSE	Diferenciación medio
SHH	I + D	1845-SH	Diferenciación medio
PDGF-AA	I + D	221-AA	Diferenciación medio
B27	Invitrogen	17504-044	Diferenciación medio
Ratón anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M2320	1:200
De conejo anti-DCX	Señalización celular	4604s	1:200
De conejo anti-GFAP	Dako	Z0334	1:200
De conejo anti-S100B	Dako	Z0311	1:200
De conejo anti-O1	dones del profesor Timothy Vartanian *		01:50
De conejo anti-O4	Regalos del profesor Timothy Vartanian *		01:50
40μm de células colador	BD Falcon	352340

* Timothy Vartanian, MD, PhD, Departamento de Neurología y Neurociencia de la Weill Cornell Medical College, Nueva York, EE.UU.