Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

Summary

Un procedimiento de cultivo a base de líquido y dispensación de C. elegans Cepas que expresan proteínas fluorescentes reportero se describe que no requiere de equipos de selección caro. Este enfoque puede aplicarse a numerosas inducible C. elegans Genes para la detección de drogas o biosensores de contaminantes.

Abstract

Selección de alto rendimiento (HTS) es un poderoso método para la identificación de moduladores químicos de los procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en las pantallas usando modelos de cultivo celular se encuentran a menudo que son tóxicos o inactivos farmacológicamente in vivo ^1-2. Proyección en modelos animales todo puede ayudar a evitar estos escollos y agilizar el camino hacia el desarrollo de fármacos.

C. elegans es un organismo multicelular modelo muy adecuado para HTS. Es pequeño (<1 mm) y puede ser económicamente culta y se distribuye en los líquidos. C. elegans es también uno de los modelos animales más manejables experimentalmente que permitan la identificación rápida y detallada de las drogas el modo de acción ^3.

Se describe un protocolo para el cultivo y distribución de las cepas fluorescentes C. elegans para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas o detección de contaminantes ambientales que alteran la expresión de un gen específico. Un gran número de gusanos de desarrollo sincronizado en un cultivo líquido, cosecha, lavado, y suspendió a una densidad definida. Los gusanos se añaden al negro, de fondo plano placas de 384 pocillos con un dispensador de líquidos peristáltica. Las moléculas pequeñas de una biblioteca de química o de las muestras de ensayo (por ejemplo, agua, alimentos o suelo) se pueden añadir a los pozos con los gusanos. En vivo y en tiempo real la intensidad de fluorescencia se mide con un lector de microplacas de fluorescencia. Este método se puede adaptar a cualquier gen inducible en C. elegans para que un periodista adecuados. Estrés inducible muchas vías de desarrollo y de la transcripción están bien definidos en C. elegans y las buenas prácticas agrarias reportero cepas transgénicas ya existen en muchos de ellos ^4. Cuando se combina con los reporteros transgénicos corresponda, nuestro método puede ser utilizado para la detección de moduladores de la vía o el desarrollo de sólidas pruebas de biosensor de contaminantes ambientales.

Demostramos nuestro C. elegans la cultura y el protocolo de dispensación con un ensayo HTS que hemos desarrollado para controlar el C. factor de transcripción collar 'n' elegans tapa SKN-1. SKN-1 y su homólogo de mamíferos Nrf2 activar genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y ^10.5 xenobióticos. Nrf2 protege a los mamíferos a partir de numerosos trastornos relacionados con la edad como el cáncer, neurodegeneración y la inflamación crónica y se ha convertido en un importante objetivo de la quimioterapia ^11-13. Nuestro análisis se basa en un reportero GFP transgénicos para la SKN-1 del gen objetivo -4 gst ^14, que codifica un ⁶ glutatión-s-transferasa. El periodista gst -4 es también un biosensor para los productos químicos xenobióticos y de oxidación, que activan SKN-1 y se puede utilizar para detectar bajos niveles de contaminantes tales como la acrilamida y el metil-mercurio ^15-16.

Protocol

1. Preparación de comida de gusanos bacteriana

Día 1

1. Añadir 5 ml de grasa saturada E. coli OP50 cultivo bacteriano a 500 ml de caldo fabuloso suplementado con 50 mg / ml de estreptomicina y crecer en una incubadora de agitación (225 rpm) durante la noche a 37 ° C.

Día 2

2. Dividir el cultivo de bacterias durante la noche en diez tubos de 50 ml y bacterias centrífuga en una centrífuga refrigerada a 2.500 rcf durante 20 minutos.
3. Decantar el caldo LB y resuspender cada sedimento bacteriano en 10 ml de líquido de los medios de comunicación nematodo crecimiento (NGM). Agitar horizontalmente en el suelo agitador durante 15 minutos para volver a suspender las bacterias. Para hacer buffer NGM, añadir 3 g de NaCl en 1 l de agua desionizada y autoclave. Enfriar a 55 ° C y añadir con el fin de las siguientes soluciones estériles: 1 ml de 1 M de CaCl _2, 1 ml de 1 M MgSO _4, y 25 ml de 1 M de fosfato de potasio, pH 6,0.
4. Centrifugar el cultivo bacteriano en una centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos.
5. Decantar buffer NGM y pesar el sedimento bacteriano.
6. Añadir un volumen igual de tampón de NGM para volver a suspender las pastillas, alícuota de 3 ml de bacterias se concentran en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C.

2. A gran escala C. elegans de cultivo líquidos

Nosotros usamos una línea transgénica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) con dos construcciones fluorescentes: Pgst -4:: GFP ¹⁴ para controlar SKN-1 actividad y PDOP 3:: PP ¹⁷ para servir como un estándar para la normalización del gusano número.

Día 1

1. Mezclar 150 ml NGM buffer, 1,5 ml de caldo de LB, 150 l de 5 mg / ml de colesterol (en etanol), y 75 l de 100 mg / ml de estreptomicina. Filtro a esterilizar la mezcla y añadir a un frasco estéril de 1 litro.
   NOTA: Agregar 1% caldo de LB para amortiguar NGM ayuda a evitar que los gusanos se pegue a la cristalería y utensilios de plástico, pero esta cantidad no es suficiente para apoyar el crecimiento de bacterias.
2. Sincronizar los gusanos con el procedimiento estándar de hipoclorito de ^{18 años.} Hasta 0,5 ml de gusanos grávidos pueden ser procesados ​​en un tubo de 15 ml solo con 5 ml de solución de hipoclorito (3,75 ml de agua estéril, 1 ml de lejía de uso doméstico, y 250 l de NaOH 10 N). Lavado de los óvulos liberados con agua estéril y se resuspenden en 10 ml de solución tampón NGM.
3. Diluir una muestra de los huevos de 100 veces en NGM tampón (por ejemplo, 100 l en 10 ml) y contar el número de huevos en tres separadas 5 alícuotas. Varios el número promedio de 200.000 (100 x factor de dilución 2000) para estimar el número total de huevos.
4. Agregar 200.000 a 2 millones de huevos en el matraz con tampón NGM y agitar la cultura a 100 rpm a 20 ° C.

Día 2

5. Por lo menos 16 horas después de añadir los huevos en el matraz, utilice una pipeta serológica estéril para retirar aproximadamente 0,5 ml de la lombricultura en suspensión. Pipeta de 5 gotas tres l en la tapa estéril de una placa de Petri. Coloque la tapa en un congelador a -20 ° C durante 1-2 minutos para paralizar los gusanos. Cuente el número promedio de gusanos vivos nacidos por cada 5 l, y luego varios en 30.000 (150 ml / 5 l) para estimar el número total de gusanos nacidos.
6. Descongelar un tubo de congelados OP50 cultivo bacteriano (Protocolo 1.6) y añadir 3 ml de 50% OP50 en la cultura del gusano por cada 500.000 nacidos gusanos. Agitar el matraz a 100 rpm a 20 ° C. Los gusanos se convierten en larvas L4 y adultos jóvenes en aproximadamente 51 horas. El OD600 de bacterias debe ser cerca de 2.200 desde el principio. Controlar la cantidad de bacterias mediante la absorción y añadir más si el OD 600 cae por debajo de 0.900.

3. Gusano de recogida y distribución

Día 4

1. Use una pipeta serológica estéril para la transferencia de aproximadamente 0,5 ml de la cultura del gusano suspendido sobre una placa de agar NGM estándar. Ver los gusanos con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la mayoría son larvas L4 y adultos jóvenes. L4 larvas tienen una mancha ventral claro en la parte media del cuerpo. Los adultos jóvenes será un poco más grande y no tendrá un lugar despejado.
2. Vierta la lombricultura en el estéril tubos de 50 ml y se colocan los tubos en un bastidor de tubo de ensayo en el laboratorio. Permita que los gusanos que conformarse con unos 10 minutos. Eliminar el sobrenadante por aspiración o la pipeta.
   NOTA: Este paso puede ser importante para eliminar los huevos no eclosionados o gusanos que no se desarrolló debido a que se asentarán más lento que larvas L4 y adultos jóvenes.
3. Recoge todos los gusanos en un solo tubo de 50 ml y lavar con buffer NGM con caldo de LB 1% (NGM LB +) 3-4 veces para eliminar las bacterias.
   NOTA: Esto se hace mejor en una centrífuga de balanceo de cubo mediante la recopilación de los gusanos a 500 rcf durante 30 segundos y reemplazar el sobrenadante con frescos NGM + tampón LB.
4. Después del lavado, llenar el tubo con NGM + tampón LB a 50 ml y se vierte en un frasco de gusano personalizado de dosificación. Agregar una barra de poca agitación y revuelo para mantener a los gusanos en suspensión. Conde ªnúmero de gusanos de correo en tres 5 gotas l como se indica más arriba. Diluir con NGM LB + hasta llegar 12-15 gusanos por 5 gota l (~ 2.5-3.0 gusanos / l).
   NOTA: Un mínimo de 20 ml (60.000 gusanos) que se necesita para llenar el espacio muerto del frasco dispensador y dispensador de cinta. Cada placa de 384 y requiere cerca de 35.000 gusanos o 11,5 ml de suspensión gusanos.
5. Cargar un casete de 10 l de dosificación y esterilizar cebado con etanol al 70%. Enjuague el etanol mediante cebado con agua estéril.
6. Inserte el extremo de la cinta de distribución en el matraz de manera que es justo por encima de la barra de agitación sin interrumpir su movimiento. Asegúrese de que los gusanos permanecen suspendidas en todo el frasco entero. Programa del dispensador para dispensar a baja velocidad con dos pre-pulsos. Primer y ejecutar al menos 10 ml de suspensión gusanos. Llenar las placas, según sea necesario con rapidez para evitar que los gusanos se asiente en el tubo.
7. Sellar las placas con cinta adhesiva transpirable.
8. Coloque las placas en una plataforma de agitación en una incubadora a la temperatura adecuada para su análisis. No apile los platos.

4. El análisis de fluorescencia

1. Coloque la placa de destino en un lector de microplacas para medir la intensidad de la fluorescencia de cada pozo con la longitud de onda apropiada de emisión y excitación (Filtros para nuestro ensayo: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
2. Calcular la proporción de GFP / RFP y normalizar las lecturas de los pozos de control (sin compuesto activador) para determinar la diferencia exacta de veces la intensidad de fluorescencia derivado de los tratamientos individuales.

5. Los resultados representativos:

Nuestra SKN-1 ensayo utiliza una cepa integrado cromosómicamente reportero dual (VP596). Como se muestra en la Figura 1, el número de gusanos se correlaciona bien con el volumen dispensado. Como se muestra en 2A y 2B, el total de las buenas prácticas agrarias y RFP cifras por fluorescencia y es altamente reproducible de un pozo a través de una placa de 384 pocillos. Como se muestra en la Figura 2C, sin inducida Pgst-4: la fluorescencia de GFP es linealmente correlacionada con PDOP-3:: Solicitud de Propuestas a través de 384 pozos. Cuando se expresa como una relación de buenas prácticas agrarias / RFP, la fluorescencia se convierte en altamente reproducible de un pozo a través de una placa de 384 pocillos (comparar el coeficiente de variación de la figura 2D a 2A) que demuestran la capacidad de la DPS-3:: reportero RFP para reducir la variabilidad. Como se muestra en la figura 3, la inducción de las buenas prácticas agrarias en relación a la RFP con un SKN-1 activar xenobióticos (38 M juglone) es sólido y altamente reproducible a través de una placa de 384 pocillos.

Figura 1. El número de gusanos en función del volumen dispensado. Los gusanos se diluyeron hasta aproximadamente 2/μl y se distribuye en una placa de 24 pocillos para el conteo manual con un microscopio estereoscópico. N = 8 pozos por unidad de volumen.

Figura 2. Fluorescencia total de gusanos se distribuye en una placa de 384 y es reproducible. Los gusanos se diluyeron a l aproximadamente 2.5/μl y 30 se distribuye en cada pocillo de una placa de 384 pocillos. GFP (A) y el PP (B) de fluorescencia de todos los pozos tenían un coeficiente de variación por debajo del 9%. (C) la fluorescencia de GFP está altamente correlacionada con la RFP de fluorescencia. (D) Cálculo de la relación de las buenas prácticas agrarias para reducir RFP el coeficiente de variación por debajo de 6% (A, B y D) Las líneas continuas indican los medios y las líneas discontinuas indican tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la media.

. Figura 3 La activación de Pgst-4:: GFP es robusta y consistente. Aproximadamente el 75 L4 gusanos fueron dispensadas en los pocillos de una placa de 384 pozos y 38 juglone M se añadió en cada columna. Las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia se midió a las 21 h de incubación. La media de ratios de fluorescencia relativa de todo control (1,0) y juglone pozos (8,9) están marcados con líneas continuas. Tres desviaciones estándar por encima de la media de control y por debajo de la media juglone están marcados con líneas discontinuas.

Discussion

Se presenta un método para cultivar y distribuir grandes cantidades de nematodos transgénicos. El equipo utilizado para el cultivo de lombrices es el estándar para los laboratorios que realizan la clonación molecular y el manejo de líquidos y el equipo de fluorescencia es el estándar para los laboratorios de procesamiento de un gran número de microplacas. Otros métodos de dispensación de un gran número de vivir C. elegans requieren partículas caro equipo de clasificación ^19. El Pgst-4: ensay...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
LB caldo	Investigación de Productos International Corp.	L24066
Excelente caldo de	Investigación de Productos International Corp.	T15100
Synergy ™ HT Multi-modo de lector de microplacas	BioTek		Filtros: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em
MicroFlo Seleccione dispensador	BioTek
Gusano de dispensación frasco	El sur de Scientific Inc., Micanopy, FL		Costumbre montado (352) 284-2531
384 microplacas	Greiner Bio-One	5678-1209
Cinta de sellado transpirable	Nunc	241205
(5-hidroxi-p-naphthoqinone) juglone	ACROS	121640010	Juglone se disuelve en DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D-5879
C. elegans transgénicos cepa	Autor de laboratorio	VP596	Pgst-4:: GFP y PDOP 3:: SDP