Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

Resumen

Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar repetitivas En vivo de la médula espinal utilizando microscopía de dos fotones se describe. Este método combina un dispositivo de estabilización de la columna y un régimen anestésico para reducir al mínimo las vías respiratorias inducida por los movimientos y producir imágenes de los datos en bruto que no requieren la alineación o de otro tipo de post-procesamiento.

Resumen

Imágenes in vivo utilizando microscopía de dos fotones ¹ en ratones que han sido genéticamente modificadas para expresar proteínas fluorescentes en células específicas de los tipos ^2.3 ha ampliado significativamente nuestro conocimiento de los procesos fisiológicos y patológicos en numerosos tejidos in vivo ^4-7. En los estudios del sistema nervioso central (SNC), ha habido una aplicación amplia de imágenes in vivo en el cerebro, lo cual ha producido una plétora de nuevos hallazgos y muchas veces inesperados sobre el comportamiento de las células como las neuronas, astrocitos, microglia, en condiciones fisiológicas o patológicas ^08.17. Sin embargo, las complicaciones técnicas en su mayoría han limitado la implementación de imágenes in vivo en los estudios de la médula espinal de ratón vivo. En particular, la proximidad anatómica de la médula espinal a los pulmones y el corazón genera artefacto de movimiento significativo que hace imágenes de la médula espinal que viven una tarea difícil. Hemos desarrollado un método novedoso que supera las limitaciones inherentes de las imágenes de la médula espinal mediante la estabilización de la columna vertebral, la reducción de las vías respiratorias inducida por los movimientos y facilitando así el uso de la microscopia de dos fotones de la imagen de la médula espinal de ratón in vivo. Esto se logra mediante la combinación de un dispositivo a medida estabilización de la columna con un método de anestesia profunda, lo que resulta en una reducción significativa de las vías respiratorias inducida por los movimientos. Este protocolo de vídeo muestra cómo exponer una pequeña zona de la médula espinal de vida que se puede mantener en condiciones de estabilidad fisiológica durante largos períodos de tiempo manteniendo la lesión tisular y el sangrado al mínimo. Representante imágenes primas adquiridas en detalle vivo en alta resolución, la estrecha relación entre la microglia y la vasculatura. Una secuencia de timelapse muestra el comportamiento dinámico de los procesos microgliales en la médula espinal de ratón vivo. Por otra parte, un análisis continuo de la misma z-marco demostrars de la excelente estabilidad que este método puede lograr la generación de pilas de imágenes y / o películas timelapse que no requieren la alineación de la imagen después de la adquisición. Por último, se muestra cómo este método puede ser utilizado para revisar y crear la imagen de la misma zona de la médula espinal en los puntos de tiempo posteriores, teniendo en cuenta los estudios longitudinales en curso de los procesos fisiológicos o patológicos en vivo.

Protocolo

1. La construcción del dispositivo de estabilización de la columna

1. Para la misión STS-A Narishige abrazaderas compacto de la médula espinal y el Narishige MA-6N adaptador de cabeza afirmado.
2. Diseño personalizado y hacer una placa base de acero inoxidable para mantener las dos partes Narishige en la alineación de modo que la cabeza del animal con el apoyo, mientras que su columna vertebral y la cola se sujetan. Tenga en cuenta que todo el dispositivo debe caber bajo el lente de un microscopio por lo general en una platina del microscopio baja.

2. Cirugía en animales

1. Pre-calentar el microscopio de la cá....

Discusión

El método aquí descrito permite estable y repetitiva de imágenes in vivo de la densamente poblada estructuras fluorescentes celular en la médula espinal de ratones anestesiados utilizando microscopía de dos fotones. La estabilidad alcanzada es el resultado de un dispositivo de estabilización a medida la columna vertebral y un régimen anestésico que reduce las vías respiratorias inducida por el artefacto de movimiento. El dispositivo de estabilización de la columna permite el espacio para respirar debaj.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rodamina B dextrano	Invitrogen	D1841	70 kDa, se diluye en ACSF (3% w / v)
La ketamina HCl	Bionichepharma	No NDC: 67457-001-10	Inyectables, 50mg/ml
Anased	Lloyd Laboratorios	NADA No: 139-236	Xilazina inyectables, 20mg/ml
Acepromacina	Vedco	NADA No: 117-531	Inyectables, 10mg/ml
Las lágrimas artificiales ungüento	Fénix farmacéutico	No NDC: 57319-760 - 25	Lubricante
Betadine	Pescador	19-061617
McPherson-Westcott Tijeras	World Precision Instrumentos	555500S	Curvas, con puntas romas tijeras
Pinzas rectas	World Precision Instrumentos	555047FT	Pinzas dentadas punta
Cauterizar los vasos pequeños	Herramientas de Bellas Ciencia	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc.	Mixer Mill MM400
La médula espinal compacto abrazaderas	Narishige	STS-A
Sosteniendo la cabeza de adaptador	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences Corp.	80-6421-43
Ringer lactato	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC No: 12496 - 6757-1	La buprenorfina, inyectables
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Enrofloxacina, inyectable antibacteriano 2,27% (20 ml)
Cojín de la calefacción - Grande	Herramientas de Bellas Ciencia	21060-10