Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Resumen

Este monte se In situ Protocolo de hibridación se analizan los pasos críticos que garantizan resultados reproducibles de alta calidad para estudios de expresión génica en E8.5-E11.5 embriones de ratón días de edad.

Resumen

Todo el montaje hibridación in situ es un enfoque muy informativo para la definición de patrones de expresión genética en los embriones. La hibridación in situ en los procedimientos son largos y técnicamente exigente con varios pasos importantes que en conjunto contribuyen a la calidad del resultado final. Este protocolo describe en detalle varios pasos clave de control de calidad para el etiquetado de la optimización de la sonda y el rendimiento. En general, el protocolo ofrece una descripción detallada de las medidas necesarias fundamental para obtener resultados de alta calidad reproducible. En primer lugar, se describe la generación de digoxigenina (DIG) marcado con sondas de ARN mediante transcripción in vitro de las plantillas de ADN generados por PCR. Se describen tres ensayos críticos de control de calidad para determinar la cantidad, la integridad y la actividad específica de la etiqueta DIG-sondas. Estos pasos son importantes para la generación de una sonda de la sensibilidad suficiente para detectar ARNm endógeno en un embrión de ratón entero. Además, se describen los métodos para la fijación y almacenamiento de E8.5-E11.5 embriones de ratón días de edad para la hibridación in situ. A continuación, se describen los métodos detallados para la digestión de proteinasa K limitado de los embriones rehidratado seguido de los detalles de las condiciones de hibridación, lavados post-hibridación y el tratamiento de RNasa para eliminar inespecíficos hibridación de la sonda. Un anticuerpo AP-conjugado se utiliza para visualizar la sonda marcada y revelar el patrón de expresión de la transcripción endógena. Los resultados representativos se muestran a partir de experiencias exitosas y las típicas experiencias óptimas.

Protocolo

1. Riboprobe generación a través de la transcripción in vitro

1. La preparación de productos de PCR para las plantillas de transcripción in vitro.
   1. El diseño de cebadores de PCR con las secuencias de fagos promotor de la transcripción en sus extremos 5 '.
      Nota: La secuencia promotora añadido a extremo 5 'del primer sentido capítulo de PCR se utiliza para la transcripción de la sonda de sentido, y la secuencia del promotor añadido a extremo 5' del primer antisentido PCR será utilizado para la síntesis de la sonda anti-sentido ^1.3. No hemos detectado ninguna diferencia en la e....

Discusión

Los métodos descritos en este protocolo ha sido adaptado de una serie de fuentes diferentes y optimizado para montaje en toda E8.5-E11.5 embriones día de vida del ratón. Los métodos para montar toda la hibridación in situ de embriones de los vertebrados aparecieron por primera vez a principios de 1990 ^2,5-12. Este protocolo fue adaptado sobre todo de los métodos desarrollados para embriones de Xenopus ^7,8 y ^2,11 ratón. En nuestro protocolo de una gran cantidad de se hac.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre	Tipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Digoxigenina-11-uridina-5'-trifosfato	Reactivo	Roche	11209256910
Ribonucleósido Set trifosfato	Reactivo	Roche	11277057001
Columnas Un paseo rápido por la purificación de ARN radiomarcado	Suministro	Roche	11274015001
T7 RNA polimerasa	Reactivo	Roche	10881767001
SP6 RNA polimerasa	Reactivo	Roche	10810274001
T3 ARN polimerasa	Reactivo	Roche	11031163001
CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 Ci	Reactivo	Perkin Elmer	BLU008X250UC
DNasa I recombinante, libre de RNasa	Reactivo	Roche	4716728001
Urea, cristales incoloros a blancos o polvo cristalino	Reactivo	Pescador	BP169-500
Gel de tampón de carga	Reactivo	Ambion	AM8547
Hybond-N +, Amersham	Suministro	GE Healthcare	RPN82B
UV Stratalinker 2400	Equipo	Stratagene
Dietil pirocarbonato	Reactivo	Sigma	D5758-100ML
Heparina sódica	Reactivo	Acros	41121-0010
peróxido de hidrógeno al 30% en agua	Reactivo	Fisher Scientific	BP2633-500
Glutaraldehído, el 8% de grado EM	Reactivo	Polysciences	0 / 710	Utilizar con precaución de acuerdo con las instrucciones del fabricante de
El bloqueo de los reactivos	Reactivo	Roche	11096176001	Convertirlo en un 5% de acciones y almacenar a -20 ° C
Proteinasa K	Reactivo	Roche	3115852001
RNasa A	Reactivo	Roche	10109142001	Hacer como 10 mg / ml y almacenar a -20 ° C.
RNasa T1	Reactivo	Roche	10109193001
Ultrapura formamida	Reactivo	Invitrogen	15515-026
Levamisol clorhidrato	Reactivo	ICN Biomedicals. Inc	155228
El ácido ribonucleico de la levadura torula, Tipo VI	Reactivo	Sigma	R6625	fenol / cloroformo y precipitado en varias ocasiones, se resuspendió en DEPC dH2O y se almacenan a -20 ° C
Anti-digoxigenina-AP Fab fragmentos	Reactivo	Roche	11093274910
BM púrpura AP sustrato, lo que precipitó. Listo para usar la solución.	Reactivo	Roche	11 442 074 001
4 ml, transparente, cerrado arriba, Vial de almacenamiento de conveniencia para la antorcha	Suministro	Científica nacional	B7800-2
Shake N Hornee horno de hibridación	Equipo	Boekel Científico	136400
Biopsia del Seguro-Tek	Suministro	Fisherbrand	15 a 200-402C
Además Paraplast tejido medio de inclusión	Reactivo	Fisherbrand	23-021-400
Pele-A-Way moldes de plástico desechables tejido incrustación	Suministro	Polysciences	18646A
Además Colorfrost Portaobjetos	Suministro	Fisherbrand	12-550-17
Fast Red nuclear	Reactivo	Sigma	N8002
Cytoseal 60	Reactivo	Richard Allan-Científico	8310-16