Summary
Метод сохранения, выявления и последовательность РНК из вирусов птичьего гриппа была подтверждена и расширенного использования природных образцах помета от птиц. Эта техника устраняет необходимость поддержания прохладно цепи и обработки инфекционных вирусов и может применяться в 96-и высокую пропускную способность установки.
Protocol
1. Перехват Дак и клоаки Свабирование
- Ловушка речные утки рода Anas (или другой птицы) в клетке за счет привлечения их заманить уток или продуктов питания, и поместить их в отдельные коробки плате карты. Транспорт раз в соответствующем окне должно быть сведено к минимуму, например, путем установки полевая станция находится на небольшом расстоянии к ловушке. Логистическая обстоятельства могут меняться в каждом исследовании. Советы и утверждения соответствующих животных комитета по этике должна быть искали для каждой новой установки. Кроме того, также охотник выстрелил птицы могут быть отобраны.
- Возьмите утку из коробки, удерживая ее крылья плотно прилегает к его телу. Пример свежий снижается, которая будет присутствовать в большинстве случаев, непосредственно из нижней части окна. Забрать их стерильным тампоном и нанесите жидкость для карт ватмана ССТ. Если нет, выполните клоаки моечные.
- Включите утку на спину. Это дает возможность доступа к клоаке и облегчает отбор проб. Клоаки выступающие структура расположена ниже живота, ближе к основанию хвоста. Опытный человек мог держать и образцы птицы в то же время, или же второй человек может помочь.
- Осторожно вставьте стерильные пластиковые района тампоном (Копан, Италия) около 1 см и сделать нежным вихрем клоаку. Ролл тампон жидкостей из клоаки по поверхности карты ватмана ССТ. После отбора проб был выполнен немедленно освободить животное является желательным.
- Сухой FTA карт при комнатной температуре не менее 1 часа, затем сохранить каждый образец индивидуально в бумажных пакетах (например, конверты). Хранение можно при комнатной температуре, возможно, с бисером кремнезема во влажном климате. Отправка и получение биобезопасности учреждений офицеры могут позволить отправить FTA карты по почте, так как возбудители становятся неактивными при контакте с поверхностью карты ЗСТ.
2. Вирусный изоляции РНК
- Извлечение материала FTA карты, включая фекалии / клоаки жидкость. Удар три диска с Харрисом 2 мм перфоратор и место всех тех, в скважины пластины РНКазы свободной 96well. Между каждым нового образца, чистый панчер осторожно с алкоголем и точность Ким протрите (KIMTECH). Всегда используйте положительные и отрицательные контроли. Положительного контроля может состоять из лабораторного штамма свеженанесенный на карту зоны свободной торговли, или природном образце которого знаете, получая положительный результат. Как отрицательный контроль, выбивать диски из пустой картой ЗСТ. Кроме того, оставьте другой хорошо бесплатным для контроля ПЦР позже в эксперименте (с водой как шаблон).
- Добавить 70μl РНК быстрой экстракции раствором (Амбион) и рулонн пластины (AbGene Термо-Sealer). Выдержите 5 минут на планшетном шейкере при комнатной температуре определяется скоростью, которая не вызывает перелив (это зависит от используемой модели пластины шейкер; тест заранее).
- Проведение вирусных РНК изоляции в соответствии с протоколами производителя с MagMAX-96 вирусных РНК изоляции комплект (Амбион). Вкратце: Добавить 130μl подготовлены лизиса / обязательные решения (из комплекта) в каждую лунку. Передача 50 мкл извлеченные FTA карты материала в каждую лунку. Встряхните пластины на 1 минуту.
- Добавить 20 мкл подготовленных шарик смеси (из комплекта) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Встряска на определенные скорости в течение 5 минут. Молекулы РНК связываются с магнитными бусами.
- Перемещение пластины для магнитного 96-луночного стоять, чтобы захватить бисером. В зависимости от модели магнитной стенд используется, это может занять более 5 минут. Когда раствор получился совершенно ясно, удалить и уничтожить супернатант. Затем удалить пластину из магнитного стенда.
- Вымойте бисером дважды промывочного раствора 1 и дважды промывочного раствора 2 (из комплекта). Для каждого из 4 шагов мыть добавить 150 мкл приготовленного раствора мыть к каждой пробе, встряхивать в течение 1 минуты определяются скорость, перемещение пластины магнитного стенд, захват бисером в течение приблизительно 5 минут (или пока раствор не вполне ясно), удалять и отбросить супернатант. Затем удалить пластину из магнитного стенд, добавить следующее решение мыть, и проводить промывки, как раньше. После последней промывки, удалить как можно больше моющего раствора, как это возможно и сухой воздух бисером при комнатной температуре в планшетном шейкере в течение 2 минут.
- Добавить 50 мкл буфера элюирования (из комплекта), чтобы освободить РНК из бисера и встряхивают в течение 4 минут на пластину шейкер. Захват бисером, как описано выше. Супернатант теперь содержит изолированных РНК, которая готова для последующих применений.
3. RT-PCR из ВГП Матрица Гена
Провести обратной транскрипции ПЦР (RT-PCR) с One-Step доступа RT-PCR системы (Promega) в 25 мкл реакции (в диапазоне от Краус и др. 18 и Fouchier и др. 22..):
| Нуклеазы свободной воды | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 буфер 5 мкл | |
| дНТФ | 0.5μl |
| Грунтовка M52C 22 (10 мкм) | 2.5μl |
| Грунтовка M253R 22 (10 мкм) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 мМ) | 7μl |
| AMV обратной транскриптазы (5u/μl) | 0.5μl |
| TFL полимеразы (5u/μl) | 0.5μl |
| РНК образца | 5 мкл |
Условия ПЦР в Biometra T1 амплификаторе являются: начальный обратной транскрипции 45 минут при 45 ° C, затем 2 минуты начальная денатурация при 94 ° С и 40 циклов: 94 ° С в течение 1 минуты, 56 ° С в течение 1 минуты, а 68 ° С в течение 2 минут. Дополнительное удлинение 7 минут при 68 ° C заключает усиления.
4. Скрининг на АИ-положительные образцы и очистки целевых фрагментов из геля
- Нагрузка 2μl продукта ПЦР смешанного с 5x 2μl красителя нагрузки (BioRad) и 6μl воды на 1% агарозном геле (Roche) окрашивали 1% этидия бромид (2.5μl на 100 гель мл) для предварительного отбора.
- Выполнить гель течение 1 часа при 120 В, наряду со стандартным размером ДНК (BioRad EZ нагрузка 100 б.п. лестнице), визуализировать с документацией по системе гель. Смотрите пример на рисунке 1.
- Выберите образцы с амплифицированных фрагментов в ожидаемый диапазон размеров (от 200 б.п. и 300 б.п. (целевой фрагмент 244 пар оснований). Нагрузки всей реакции ПЦР объем (из которых ~ 23μl осталось) из этих кандидатов с 5-кратным 6μl красителя нагрузки на 2 бромид этидия% агарозном геле, окрашивали и запустить в течение 2 часов.
- Место гель на УФ-transilluminator (Bioblock Scientific) и осматривается. Смотрите пример на рисунке 2. Акцизный полосы нужного размера из геля с помощью скальпеля и помещены в отдельные пробирки на 1,5 мл реакции. Purify фрагментов из геля, например, с Zymoclean ДНК гель Восстановление Kit (Zymo исследований).
5. Секвенирование и идентификации продуктов ПЦР
- Провести Сэнгер секвенирования целевой фрагменты, например, на ABI 3730 капиллярной секвенсор с ABI Большой Dye 3,1 химия (Applied Biosystems). Подготовка последовательность реакций в 10 мкл томов, содержащих 10-20 нг гель-очищенной шаблон кДНК, 1.75μl 5x буфера разбавления, 0.5μl Большой Dye V3.1 премикс, 1 мкл прямого праймера (M52C 20, 10 мм), а ddH2O. Велоспорт условиями являются: 1 мин начальной денатурации, после 25 циклов: 10 секунд при 96 ° С, 5 с при 45 ° С и 4 мин при 60 ° C. Purify и подготовить последовательность реакций в соответствии с вашими внутренними протоколами.
- Определить результате кДНК против нуклеотидных баз данных, таких как GenBank23, например, веб-инструменты, такие как взрыв на Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Представитель Результаты:
Кряквы (Anas platyrhynchos) были отобраны на Ottenby Птица обсерватории в декабре 2007 года. От каждого кряква образца на FTA карта была взята, как описано в данном протоколе. После доставки, FTA карты хранились в морозильнике при температуре -20 ° С в течение двух лет. Же карта FTA образец лаборатории изолировать испытания в Краус и соавт. 18 был включен в качестве положительного контроля, а также девять десятикратно серийные разведения его. Два отрицательных контролей были я) извлечение из пустых карт FTA, чтобы проверить, есть ли перенос средств с нокаутером, и б) RT-PCR реакции, в которой нуклеазы свободной воды был использован в качестве шаблона, чтобы проверить, если заражение произошло во время или в подготовке реакции ПЦР.
84 образцов были проанализированы. Гель картину продуктов ПЦР из этих 84 образцов можно найти на рисунке 1. Из натуральных образцов множества неспецифических полосы можно наблюдать из-за наличия различных примесей микроорганизмов в фекалиях. Тем не менее, целевой фрагмент пары праймеров составляет 244 б.п. долго. Весь ПЦР-реакции объема подмножество образцы, которые производятся фрагменты примерно правильный диапазон размеров (от 200 б.п. и 300 б.п.) был загружен на гель (рис. 1). Иллюстрация того, какие из полос, вырезанных из геля можно найти в дополнительном рисунке 1. В дополнение к положительным контролем, два из этих образцов (69899 и 69912) были положительны на новый протокол. BLAST поиска по базе данных NCBI нуклеотидных установлена личность, как А. И. матрицу гена (рис. 3), тогда как все другие группы напоминали бактериальных последовательностей, наиболее тесно, или не дали последовательность читается на всех.
Рисунок 1. Гель картину предварительный отбор продуктов ПЦР. 2 мкл продукта ПЦР положительный контроль, зПерс разведений положительного контроля, два отрицательных контролей и 84 клоаки образцы были загружены. 48 образцов представлены в верхней панели гель, и 48 образцов в нижней панели. Красные стрелки указывают геля полосы для 100 б.п. стандартного размера ДНК. Для иллюстрации, красные кружки полосы ожидаемого размера диапазона. Синие кружки неспецифической ампликона (вверху слева) или артефакт грунтовки димера ниже 100 б.п. по размеру (внизу справа).
Рисунок 2. Отбор образцов с фрагментами в правильном диапазоне размеров. Образцы с полос частот между 200 б.п. и 300 б.п. (целевой фрагмент 244 пар оснований) были выбраны. Зеленая стрелка указывает на положительный контроль, две красные стрелки указывают образцов, которые были подтверждены быть AIV положительные путем сравнения их кДНК последовательностей нуклеотидных NCBI базе данных.
Рисунок 3. Экран захвата представитель поиска BLAST в NCBI. Одной из кДНК последовательностей, полученных от вырезали фрагменты Был задан вопрос в отношении нуклеотидных баз данных на веб-сайте NCBI. Образец правильно определил, как А. И. фрагмента гена Matrix. Для просмотра полную версию этого изображения, нажмите здесь.
S1 Дополнительный рис. Полосы отобранных образцов вырезали из геля. Эта фотография была сделана из геля, изображенный на рис 1 после кандидатом полос частот между 200 б.п. и 300 б.п. были вырезаны.
Discussion
Протокол, описанный здесь, обеспечивает дополнительный метод для выявления фекального или аналогичных образцов на наличие ВГП. Он был специально разработан, чтобы сделать пробы быстро и легко. Это дает возможность для менее образованных лиц, например, охотники или диких животных, менеджеров, внести свой вклад в наблюдение AI. Нет прохладный цепи должны применяться, хотя и замораживания образцов рекомендуется там, где это возможно. Несколько дней комнатной температуре, например, во время транспортировки в лабораторию, не были проблемой для молекул РНК на картах FTA тех пор, пока карты остались сухими. Прочие охлаждение систем хранения данных, которые в настоящее время оцениваются научным сообществом, таких как алкоголь 15 или гуанидина 16, требуют специальных механизмов доставки из-за их опасный характер. В отличие от метода FTA карта не требует перевозки опасных материалов. Тем не менее, еще один интересный носитель в этом отношении является RNAlater ™, которые не являются опасными, либо 17. Анализ проб может быть осуществлена в любой стандартной молекулярной лаборатории. Никакого специального оборудования, кроме обычного для реакции ПЦР и секвенирования капиллярной было необходимо. Все шаги могут быть осуществлены без уровень биобезопасности, потому что уже на пробы потенциальных патогенных агентов были инактивируется антибактериальной и противовирусной активности карта FTA.
Перекрестного загрязнения и последующего ложных положительных образцов не наблюдалось в наших исследованиях с дикими образцы птицы. Однако при работе с РНК и ПЦР всегда целесообразно обратить особое внимание на чистые рабочие места и отдельные комнаты для пред-и пост-ПЦР шагов. Работа в вытяжной шкаф снижает риск аэрозольного загрязнения в лаборатории. Пипетирование должна осуществляться с фильтром советы.
Из предыдущих исследований на образцах, взятых одновременно из одной утки мы знаем, что шесть из 84 образцов были положительными по традиционной RealTime RT-PCR метод 24 и Ct значения от RealTime RT-PCR известны. Два положительных образцах обнаружены нашего метода вытекают из утки которая Ct значения <30 (что указывает на высокую концентрацию вирусной РНК). Других четырех образцов, которые были положительны с традиционным протоколом, Ct значения> 30 (менее концентрированный) и не могли быть обнаружены с помощью нашего протокола.
Только образцы с относительно высоким титром вируса были положительными в нашем анализе, и вполне вероятно, что чувствительность метода была источником неспособность обнаружить все положительные пробы. Кроме того, размер выборки в данном исследовании была очень низкой, и метод может быть полностью разработаны и оценены, если более контролируемой и строгие эксперименты проводятся. Однако, если эти образцы были бы собраны из отдаленной местности, традиционного анализа не было бы вообще возможно. Кроме того, эти первые результаты обусловлены пилот эксперименты, которые нуждаются в дальнейшей оптимизации. Течение двух лет хранения в обычном -20 ° C морозильник после пробы, вероятно, также повлияло на качество вирусной РНК. Это возможно снижение РНК является важной проблемой при работе с комнатной температуре хранения инактивированных вирусов. Образцы хранятся в альтернативных жидкостей, как упоминалось выше страдают от значительного снижения, который влияет анализ больше участков вирусного генома 16. Хотя это и не проверены в нашем исследовании, открыто карты оказались хорошо подходит для сохранения интактных молекул РНК в других системах РНК, которые очень похожи на вирусы птичьего гриппа 25, 26.
Disclosures
Захват, обработка и отбор проб птиц были сделаны следующие национальные законодательства и были одобрены Шведский совет по вопросам сельского хозяйства и исследований животного комитета по этике.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
- Pulido, F. The genetics and evolution of avian migration. BioScience. 57, 165-174 (2007).
- Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists. Waterbirds. 29, 243-257 (2006).
- Taubenberger, J. K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).
- Butler, D.
- Normile, D. Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1. Science. 312, 1451-14 (2006).
- Si, Y. Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns. Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).
- Si, Y. Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe. Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).
- Chen, H. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China. J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).
- Gaidet, N. Avian influenza viruses in water birds. Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).
- Krauss, S. Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange. PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).
- Parmley, E. J. Wild bird influenza survey, Canada, 2005. Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).
- Wallensten, A. Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe. Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).
- Munster, V. J. Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests. J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).
- Latorre-Margalef, N. Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks. Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).
- Runstadler, J. A. Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005. Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).
- Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces. Avian Dis. 51, 965-968 (2007).
- Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA. J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).
- Kraus, R. H. S. Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues. Wildfowl. , 215-223 (2009).
- Smith, L. M., Burgoyne, L. A. Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper. BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).
- Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA). Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).
- Rogers, C., Burgoyne, L. Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure. Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).
- Fouchier, R. A. M. Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene. J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W.
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).
- Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus. Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).
