Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido en Saccharomyces cerevisiae, Con una biblioteca dispuestos plásmido y un protocolo de transformación de alto rendimiento de la levadura con un robot de manejo de líquidos.
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Artículo de método
La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido
En este artículo
Resumen
Resumen
La incipiente levadura, Saccharomyces cerevisiae, es un modelo de sistema de gran alcance para la definición de los mecanismos fundamentales de muchos procesos celulares importantes, incluidos los que tienen relación directa con la enfermedad humana. Debido a su corto tiempo de generación y bien caracterizado del genoma, una gran ventaja experimental del sistema de modelo de la levadura es la capacidad de realizar exámenes genéticos para identificar los genes y las vías que están involucrados en un proceso determinado. En los últimos treinta años, tales exámenes genéticos se han utilizado para dilucidar el ciclo celular, la vía secretora, y muchos aspectos más altamente conservadas de la biología de las células eucariotas 1-5. En los últimos años, varias bibliotecas genoma de cepas de levadura y plásmidos se han generado 6.10. Estas colecciones permiten ahora a la interrogación sistemática de la función genética utilizando la ganancia y la pérdida de la función de los enfoques 11-16. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado para el uso de un protocolo de levadura de alto rendimiento de transformación con un robot de manejo de líquidos para llevar a cabo una pantalla sobreexpresión plásmido, vestida con una biblioteca de 5.500 plásmidos de levadura. Hemos estado utilizando estas pantallas para identificar modificadores genéticos de toxicidad asociados con la acumulación de la agregación de las proteínas humanas expuestas a la enfermedad neurodegenerativa. Los métodos que aquí se adaptan fácilmente al estudio de otros fenotipos celulares de interés.
Protocolo
1. Los preparativos para la transformación de la levadura
Este protocolo está diseñado para diez placas de 96 pozos, pero se puede escalar hacia arriba o hacia abajo según corresponda. Hemos encontrado que este protocolo no funciona bien desde hace más de veinte placas de 96 pozos por cada ronda de la transformación. El procedimiento de transformación completa (desde el paso I.3) tendrá una duración aproximada de ocho horas.
- Alícuota de 5 10μL de ADN plásmido (100 ng / l) de la biblioteca de la levadura FLEXGene ORF en cada pocillo de un fondo redondo de 96 pocillos con el manejador de RapidPlate Biorobot líquido. Lugar descubi....
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Discusión
Aquí se presenta un protocolo para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento de la sobreexpresión plásmido en la levadura. Este método permite la detección rápida e imparcial de modificadores genéticos de muchos fenotipos celulares distintos. Con este enfoque, un investigador puede filtrar una parte importante del genoma de la levadura en cuestión de semanas. Este enfoque no sesgado también permite la identificación de los modificadores, que pueden no haber sido predicho sobre la base de los resultados anteriores. .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca del Centro de Investigación Packard para la ELA en la Universidad Johns Hopkins (ADG), Premio a la Innovación Nuevo un director de los NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), el Premio de la Fundación Rita Allen Académico. ADG es una beca Pew en las ciencias biomédicas, con el apoyo de The Pew Charitable Trusts.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 perno replicador (Frogger) | V & P Científico | VP404 | |
| FLEXGene ORF biblioteca | Instituto de Proteómica de Harvard Medical School | ||
| Centrífuga de mesa | Eppendorf | 5810R | |
| Frasco de 500 ml desconcertado | Bellco | 2543-00500 | |
| 2,8 litros de tres desconcertado Fernbach frasco | Bellco | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate puntas de pipeta | Axygen | ZT-100-RS | |
| 200μL Rapidplate puntas de pipeta | Axygen | ZT-200-RS |
Referencias
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R.
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Reimpresiones y permisos
