Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas

Resumen

En este caso, hemos establecido un método para la prueba de eficacia del fármaco con la pieza quirúrgica de los tumores cerebrales, llamado "método de explante del tumor". Con este método, podemos evaluar la eficacia del medicamento sin romper el microambiente de los tumores sólidos. Para validar la fiabilidad de este método, se describen los datos representativos de nuestra muestra de glioma tratadas con la actual primera línea del agente quimioterapéutico, la temozolomida.

Resumen

Las terapias actuales para el glioma maligno sólo tienen efecto paliativo. Para el desarrollo terapéutico, un obstáculo es la discrepancia de la eficacia determinada por las actuales pruebas de eficacia del fármaco y la eficacia en los pacientes. Por lo tanto, nuevos métodos y confiable para evaluar la eficacia del medicamento están garantizados en la fase pre-clínica. Cultivo in vitro de los tejidos tumorales, incluidas las líneas celulares, cuenta con importantes alteraciones fenotípicas, genéticas y epigenéticas de las células de cáncer causado por el medio artificial de cultivo, lo que puede no reflejar la biología de los tumores originales in situ. Modelos de xenoinjerto con los ratones inmunodeficientes también tienen sus limitaciones, es decir, la falta de sistema inmunológico y las discrepancias entre especies genéticas y epigenéticas en el microambiente. Aquí, demostramos un nuevo método utilizando los especímenes quirúrgicos de los gliomas malignos, como bloques de tumor no disociadas para evaluar los efectos del tratamiento. Para validar este método, los datos actuales con los de primera línea agente quimioterapéutico, la temozolomida (TMZ), se describen.

Se utilizó la pieza quirúrgica recién eliminado de los gliomas malignos para nuestros experimentos. Se realizó la inyección intratumoral de TMZ o candidatos de otras drogas, seguido de la incubación y el análisis de piezas quirúrgicas. En este caso, hemos tratado de establecer un método de tejido explante del tumor como una plataforma para determinar la eficacia de la novela de terapias contra el cáncer, para que podamos ser capaces de superar, al menos, algunas de las limitaciones actuales y salvar la brecha existente entre la corriente experimental datos y la eficacia en tumor de un paciente real. Este método puede tener el potencial para acelerar la identificación de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de cánceres sólidos.

Protocolo

1. Preparación de los medios de comunicación

1. Los medios de comunicación fue elaborado con 10% de SFB (16140-071 - GIBCO) en DMEM/F-12 (1X), líquido 01:01 (10.565-042 - Invitrogen) con 0,6% de solución de agar purificado, Granulado (1.01614.1000-EMD ). Condiciones de esterilidad se mantuvieron durante todo el experimento.
2. Para la preparación de 5 ml de medios de FBS (16.140-071 - GIBCO) se añadió a 45 ml de DMEM/F-12 (1X), líquido 01:01 (10565-042 - Invitrogen) haciendo volumen final de 50 ml. Los medios preparados se mantuvo en un baño de agua a 37 ° C de temperatura.
3. La solución de agar se prepara mediante el método de microondas el calor. 0,3 gramos de agar granulado se disolvió en 50 ml de agua destilada utilizando microondas. La solución de agar se enfríe a 37 º C de temperatura, manteniendo que en el baño de agua.
4. Se utilizó el mismo volumen de los medios de comunicación desde el paso 1.2 y 1.3 y la solución madre preparada. La proporción de 0,6% de agar (0,5 ml) y el 10% FBS-D-MEM/F-12 los medios de comunicación (0,5 ml) fue de 1:1, por lo que el volumen total de 1 ml en cada pocillo de placas de 6 pocillos.

2. Procesamiento de tejidos

1. El glioblastoma multiforme (GBM) los tejidos se recibieron inmediatamente después de la cirugía del Departamento de Patología. El tejido fue clasificado como GBM, del Departamento de Patología.
2. El tejido fue transferido al patri-placa con las pinzas con cuidado y se lava con 5 ml 1XPBS helada durante 3 horas.
3. Las secciones seriadas de las muestras fueron cortadas de las muestras disecadas para crear bloques de tumor (aproximadamente 10 mm de diámetro) con una cuchilla quirúrgica (Feather, 2976 # 10) y pinza (Fisher Scientific).
4. Los bloques fueron trasladados en una placa de 6 pocillos. Cada 1 ml y se contiene de los medios de comunicación mencionan en el paso 1.4. El tejido había suficiente exposición al aire para mantener el tejido viable.
5. Bloques tumorales fueron inyectados con cualquiera de DMSO (5%) o TMZ (2,5 nM) y se incubó durante 16 horas a 37 ° C en aire humidificado contiene 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) o TMZ fue inyectado 3 veces en los bloques de tumor en diferentes lugares para un tratamiento coherente. La droga fue inyectada con jeringa de insulina 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Point Comfort-26027).
6. Después de 16 horas los bloques se lavaron con 5 ml 1XPBS por 3 veces. Después de lavar los bloques se fijaron con 10 ml de 10% v / v en formol durante 24 horas (Ricca Chemical Company) en tubos de 50 ml (de Basix-5539802) y se procesa de parafina 4μm secciones.
7. La sección fijado en formol se coloca en el vaso sobre la placa de agitación con "sin calor" y procesados ​​a través de las siguientes soluciones durante 30 minutos en cada solución. 30% de etanol, etanol al 50%, 75% etanol, 80% de etanol, etanol al 95%, 100% de etanol y xileno.
8. El tejido se transfirieron a las toallas de papel y se coloca en parafina derretida (58 a 60 ° C, Fisher Paraplast parafina) durante 30 minutos.
9. El tejido se incluyó en moldes con parafina Surgipath Blue Ribbon, tejidos embebidos se enfrió a temperatura ambiente.
10. Embebidos en parafina secciones de tejido 4μm se tomaron y se coloca en Fisher diapositivas Plus.

3. Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente. ¹

1. Deparaffinization y lugar de rehidratación de las diapositivas en un bastidor y realizar los pasos siguientes. Xileno de 3x5 minutos (3 veces durante 5 minutos), etanol al 100% para los minutos de 3x5, el 95% de etanol durante unos minutos 1x5, el 70% de etanol para el 1x5 minutos, enjuague con agua corriente del grifo durante 3 minutos.
2. Antígeno de recuperación de calor inducido por diapositivas de recuperación del epítopo de lleno en tampón de citrato 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) diluido en agua destilada en un vaso de vidrio. Hervir durante 15 minutos en un plato caliente (asegúrese de que las secciones don "t caen fuera de la diapositiva). Enfriar la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos con PBS 1X de 3x5 minutos.
3. La inhibición de peróxido de internos Sumerja los portaobjetos en metanol (Fisher Scientific-A-452-4) con peróxido de hidrógeno al 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluido en agua destilada) en un vaso de cristal durante 15 minutos. Enjuague con 1X PBS para 3x5 minutos.
4. El bloqueo de la cubierta de los tejidos con suero de cabra al 10% normal. Transferencia de las diapositivas de una caja húmeda e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan los portas con PBS 1X de 3x5 minutos.
5. Secciones primaria de anticuerpos se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario en las siguientes concentraciones: la caspasa-3 humana específica (1:1000, sistemas de I + D, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluido con PBS 1X. Enjuague los portaobjetos en PBS 1X minutos 3x10 al día siguiente.
6. Reacción de los anticuerpos secundarios cubren los tejidos con 2-3 gotas de HRP etiqueta secundaria de anticuerpos (prever sistemas). Poner los portaobjetos en una caja húmeda e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar con PBS 1X de 3x10 minutos.
7. Detección de Desarrollo para el kit de cromógeno DAB (Vector laboratorios-SK-4100) para la detección de anticuerpos primaria siguiendo el protocolo del fabricante.
8. Tinción contador Sumerja las láminas con hematoxilina (10-15 s egundos, asegúrese de que don "t invadido DAB señal). Enjuague con agua corriente del grifo durante 3 minutos.
9. Sumerja la deshidratación de las diapositivas en el siguiente orden, el 70% de etanol durante 5 minutos, el 95% de etanol durante 5 minutos, 100% de etanol para los minutos de 3x5, 3x5 de xileno minutos.
10. Cubreobjetos las diapositivas con el reactivo de Permount montaje (Fisher Scientific-SP-15-100).
11. Las imágenes fueron tomadas con microscopio de fluorescencia Olympus (DP-72) .3.11). En todos los experimentos, etiquetado específico fue confirmada por el control negativo sin anticuerpo primario.

4. Los resultados representativos:

Se recogieron muestras quirúrgicas de glioblastoma multiforme (GBM). Los pacientes se sometieron a la primera cirugía sin quimioterapia previa como la temozolomida (TMZ). La imagen en T1 de la RM con gadolinio en la Figura 1a-demostró un tumor mayor en el lóbulo frontal derecho antes de la cirugía. La imagen postoperatoria (Figura 1b), confirmó la resección casi total de la lesión después de la cirugía. Los tejidos quirúrgicos fueron enviados al Departamento de Patología con el propósito diagnóstico clínico, y el resto de las muestras fueron procesadas para la obtención de tejidos en la Junta de Revisión aprobada Institucional (IRB) de protocolo en la Ohio State University Medical Center. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción demostrado la presencia de necrosis, las células pseudopallisading, y la proliferación microvascular (Figura 1-c). Por lo tanto, estos tumores fueron diagnosticados histopatológicamente como GBM. Es de destacar que los explantes de tumores después de la incubación sin TMZ hasta 48 horas mantiene la citoarquitectura de GBM. Por el contrario, con una incubación de 72 horas o más, nos dimos cuenta el aumento del número de núcleos de condensación en las muestras, lo que sugiere algunas de las células del tumor a partir de someten a la apoptosis. Como resultado, los tejidos tumorales después de la incubación ya contenía regiones irregular que perdió las células tumorales, las cuales fueron observadas preferentemente en y alrededor de las áreas necróticas (datos no mostrados).

Con el fin de investigar si estas muestras de explantes de tumores de forma fiable puede ser utilizado con el propósito de la prueba de eficacia del fármaco, hemos probado el efecto del tratamiento con TMZ. Figura 2 representa el flujo de los experimentos en este estudio. Un estudio reciente indica que la inyección intratumoral de TMZ tiene un efecto más potente sobre el control del crecimiento de los gliomas malignos que la de la administración sistémica de este medicamento ^2. Después de la incubación durante 16 horas, los explantes fueron incluidos en parafina y las secciones de serie se prepararon para la tinción. Inmunohistoquímica de tejidos tratados con TMZ GBM demostró una reducción sustancial de las células tumorales Ki-67-positivas en comparación con las muestras de control. A su vez, la inmunohistoquímica con un marcador de la apoptosis, la caspasa-3, no produjo ninguna diferencia significativa entre las muestras de glioma tratada con TMZ y las muestras de control (Figura 3).

El efecto del tratamiento con TMZ se caracterizó además por la combinación de este ensayo de explante, juntamente con el cultivo in vitro o la citometría de flujo. En concreto, hemos tratado de determinar el efecto sobre la madre similares a las células las células tumorales (SCLTC). Por lo tanto, después de un tratamiento intratumoral con TMZ, se realizó un ensayo de formación de ámbito y citometría de flujo de estos explantes tumorales. Las muestras tratada con TMZ se disocia en las células individuales de un solo y único de estas células se sembraron a una densidad baja (1 de células por microlitro o menos) en placas de 96 pocillos en medio libre de suero complementado con bFGF y EGF. En el grupo control, la formación de esferas de tumores de los explantes de tumores se observó después de 7 días de incubación. Teniendo en cuenta que la formación de la esfera es una propiedad de SCLTC ^{3 4,} alteraciones en el número de esferas del tumor mediante un tratamiento de drogas indica que el efecto sobre SCLTC. Del mismo modo, la citometría de flujo de los explantes de tumores disocian con un marcador de superficie celular, CD133, se llevó a cabo para verificar el efecto sobre la SCLTC. Si SCLTC en las células de tumor heterogéneo en GBM son selectivamente erradicar mediante el tratamiento con medicamentos, se podría predecir que la citometría de flujo detecta un descenso de la fracción CD133 positivas de un tratamiento (datos no mostrados).

Figure.1 imágenes por resonancia magnética (MRI) de un paciente GBM. Figuras representativas de la pre-operación de la Figura 1a-y post-operación Figura 1b. Figura 1c es la tinción H & E de la muestra de tejido fresco GBM. Ampliación original, 40X.

Figura. 2 El flujo experimental del experimento de bloquear la cultura. Figura 2a. Imagen de GBM recién recibido de cirugía departamento de patología. Figura 2b muestra la disección del bloque del tumor en pequeñas piezas de 10 mm con la hoja de ayuda quirúrgica. Figura 2c es la droga (TMZ) el tratamiento de los bloques de tumor usando una jeringa de insulina.

e 3 "/>
Figura. 3 inmunohistoquímica. Inmunohistoquímica de los bloques de tejido GBM inyectado con DMSO o con TMZ activa la caspasa-3 y Ki67. Hematoxilina fue utilizado para la tinción nuclear. Ampliación original, 40X.

Discusión

Hay una brecha entre la eficacia de los medicamentos en el actual pre-clínicos y modelos experimentales la eficacia en los pacientes. Más específicamente, en el campo de investigación sobre el cerebro del tumor, nuevos métodos y fiable es necesario que ayude a llenar el vacío existente entre la evaluación de los medicamentos con los actuales métodos y la eficacia en los pacientes. El ensayo se describe en este estudio es una ventaja adicional, si no una solución, para facilitar el llenado de la discrepancia de los datos experimentales y los resultados de los pacientes afectados.

En cultivos celulares in vitro preferentemente ampliar ciertos tipos de células tumorales, independientemente de las condiciones de cultivo, y sólo representan una subpoblación de todo el tumor. ⁵ Además, la transformación genética y fenotípica de la expansión de las células artificiales ocurre y es inevitable con los cultivos celulares a largo plazo . Uno de los principales obstáculos para el tratamiento de los gliomas malignos es la heterogeneidad de las células tumorales, tanto dentro de un solo tumor, y entre las muestras de tumor de ^{6, 7.} Por lo tanto, el enriquecimiento selectivo de una cierta población de células tumorales, a pesar de un tipo u otro, no puede ser un medio apropiado para determinar la eficacia de los agentes quimioterápicos en las células tumorales heterogéneos. ^{8 9} Cualquier modelo animal de los tumores cerebrales derivadas de una subpoblación de las células tumorales arrojar luces sobre la eficacia del fármaco en una subpoblación, pero no todo el tumor.

Varias limitaciones, por otro lado, aún permanecen en este método de explante del tumor. Una limitación de este tipo es el período relativamente corto de tratamiento. Desde células de tumores malignos son considerados para adquirir resistencia a la mayoría, si no todas, las terapias a través del tiempo, el control inicial del crecimiento de las células tumorales a corto plazo no puede ser reflejada por el pronóstico de los pacientes a largo plazo, como se informó recientemente con un anti- agente antiangiogénico, bevacizumab ^10. Por lo tanto, la mejora del protocolo para este ensayo de explante para conservar los tejidos por un largo período se requiere de más investigaciones. Otra cuestión es un efecto específico de una prueba de drogas en SCLTC en el tumor. Teniendo en cuenta que SCLTC son relativamente resistentes a las terapias actuales para el glioma maligno, identificación de nuevos fármacos contra el cáncer que potencialmente erradicar SCLTC se justifica. En este sentido, en la actualidad tratan de combinar este ensayo con el consiguiente explante en experimentos in vitro, como el ensayo de neuroesfera formación (datos no mostrados). Esperamos aprender más sobre los efectos, en su caso, de un candidato a fármaco en SCLTC a través de estas pruebas combinadas. Por último, utilizando pequeños bloques de muestras de tumores pueden no reflejar la totalidad del tumor poblaciones de células, como es el caso de las líneas celulares tumorales convencionales o cultivos primarios de las muestras quirúrgicas. Estos problemas a un lado, preservar el estroma del tumor, incluyendo el nicho vascular, es útil en la caracterización de los factores ambientales de las células tumorales. Por lo tanto, este ensayo puede tener potencial para evaluar cualquier estrategia terapéutica bajo condiciones fisiológicamente más relevantes.

En este caso, se estableció un ensayo para la prueba de eficacia del fármaco con explantes de piezas quirúrgicas de GBM. De hecho, con las piezas quirúrgicas a prueba, se encontró que una inyección directa de TMZ reduce la proliferación en las muestras de GBM. Este método de explantes de tejidos en teoría es aplicable a otros tumores sólidos y ofrece activos para determinar la eficacia del fármaco en el tumor de un paciente, que esperamos nos ayude a evitar un nuevo fracaso en los ensayos clínicos para el cáncer.

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
De suero bovino fetal, calificado, inactivado por calor	GIBCO	16140-071
D-MEM/F-12 (1X) Líquido 01:01	Invitrogen	10565-042
El agar-agar purificado, Granulado	EMD	1.01614.1000
DPBS para la tinción	Invitrogen	14190
Hematoxyllin	Richalrd allan ciencia	7211
10% w / v caspasa-3 en formol	Ricca Chemical Company	3810
Caspasa-3	I + D de sistemas	AF835
Ki67	Dako	15626
DMSO	Sigma	D2650
Envision sistema anti-ratón	Dako	2012-07
Envision sistema anti-conejo	Dako	2011-12
DAB-kit	Vector Lab..	SK-4100

Tabla 1. Materiales.

Nombre del equipo	Empresa	Número de catálogo
6 pocillos	Greiner un bio-	657160
Una caja de petri	VWR	25384-302
Serológicas pipeta	Axygen
Puntas con filtro	EE.UU. científica
500 micras de malla de poliéster Netwell inserción	Costar	3480
Matrigel Matriz	BD Biosciences	354230
BD jeringa de 10 ml	BD Biosciences	309604
Aguja hipodérmica de aluminio de concentradores.	Tyco Health Care	2000029
Frasco de cultivo de tejidos	Corning
Tubos de centrífuga	BASIX	5539800
Tubos delgados de pared	Eton	1107A
Quirúrgica de la hoja de acero inoxidable	Pluma	2976 # 10
Jeringa de insulina	Confort punto	26027
50 ml con tapa de rosca de tubo plano de la PAC	BASIX	5539802
Disección microscopio	Tritech
Microscopio de fluorescencia	Olimpo	DP-72
Fórceps	Fisher Ciencia

Tabla 2. Equipo.