En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

Resumen

Un método para la incorporación de ADN plásmido en murino células de la retina con el propósito de llevar a cabo ya sea ganancia o pérdida de los estudios de función In vivo Se presenta. Este método aprovecha el aumento transitorio de la permeabilidad de las membranas plasmáticas de células inducida por la aplicación de un campo eléctrico externo.

Resumen

La caracterización funcional de genes expresados ​​durante el desarrollo de la retina de mamíferos sigue siendo un reto importante. La orientación de genes para generar la pérdida constitutiva o condicional de nocauts función sigue siendo de costos y mano de obra intensiva, así como mucho tiempo. Además de estos retos, la retina expresan los genes pueden tener un papel esencial fuera de la retina que conduce a confunde no deseados cuando se utiliza un enfoque de octavos de final. Además, la capacidad de expresar ectópica de un gen en una ganancia de experimento de la función puede ser muy valioso cuando se intenta identificar un papel en la especificación del destino celular y / o diferenciación terminal.

Se presenta un método para la incorporación rápida y eficiente de los plásmidos de ADN en la retina del ratón neonatal mediante electroporación. La aplicación de impulsos eléctricos cortos por encima de una cierta fuerza los resultados de campo en un aumento transitorio de la permeabilidad de la membrana plasmática, lo que facilita la transferencia de material a través de la membrana ^1,2,3,4. Trabajo pionero demuestra que la electroporación podría ser utilizado como un método de transferencia de genes en células de mamífero mediante la inducción de la formación de poros hidrofílicos de la membrana plasmática que permite el paso de ADN altamente cargadas a través de la bicapa lipídica ^5. Continuo desarrollo técnico, ha dado como resultado la viabilidad de la electroporación como un método para la transferencia de genes in vivo en tejidos de ratón múltiples, incluyendo la retina, el método que se describe en este documento ^{6, 7, 8, 9, 10.}

Solución de ADN se inyecta en el espacio subretiniano para que el ADN se encuentra entre el epitelio retinal pigmentado y la retina del recién nacido (P0) del ratón y los impulsos eléctricos se aplican mediante un electrodo de pinza. La colocación lateral de los ojos en el ratón permite la fácil orientación del electrodo de la pinza es necesario alineación polo negativo de polo-DNA-retina-positivo. Incorporación extensiva y expresión de los genes transferidos pueden ser identificados por el día postnatal 2 (P2). Debido a la falta de una importante migración lateral de las células de la retina, las regiones y no electroporated electroporación, se generan. No electroporated regiones pueden servir como controles internos histológico en su caso.

Electroporación de retina pueden ser utilizadas para expresar un gen bajo un promotor ubicuo, como CAG, o para alterar la función de genes usando construcciones ARNhc o la recombinasa Cre. La expresión más específica se puede lograr mediante el diseño de las construcciones con los promotores de genes específicos de células. La visualización de las células por electroporación se consigue mediante construcciones bicistrónico que expresan GFP o co-electroporating una expresión GFP construir. Además, múltiples construcciones puede ser electroporación para el estudio de los efectos de genes combinatoria o ganancia simultánea y pérdida de función de genes diferentes. Electroporación retina también puede ser utilizado para el análisis genómico de elementos reguladores cis-mediante la generación de construcciones apropiadas expresión y mutantes de deleción. Estos experimentos pueden ser utilizados para identificar regiones reguladoras cis-suficientes o necesarios para la expresión genética en células específicas ^11. Experimentos potenciales sólo están limitadas por la disponibilidad de la construcción.

Protocolo

1. Preparación de plásmidos para la electroporación

La concentración de ADN necesarias para la electroporación es 5μg/μl. Esto requiere típicamente los plásmidos deseados que se amplifica con un Maxi-prep (Qiagen) o un método equivalente seguida por una purificación y concentración del ADN a la cantidad de trabajo. Los pasos siguientes describen la preparación de ADN a la cantidad de trabajo.

1. Alícuota de 100 ug de ADN (de Maxi-prep o equivalente) y se diluye el volumen de 100 L para la facilidad de manipulación.
2. Añadir fenol, la cantidad de fenol se debe calcular para obtener una aproximadamente el 60% del ADN / volum....

Discusión

En vivo electroporación representa un método rápido y eficaz para la transformación de células de la retina con plásmidos de expresión de ADN. Este método permite al investigador para llevar a cabo estudios de ganancia de función por ectópica introducción de un gen de interés bajo el control de un promotor de expresión ubicua o para realizar estudios de pérdida de función mediante el uso de las construcciones del shRNA objetivo genes de interés. Además, múltiples plásmidos de ADN puede ser electroporación al mi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Buffer de fenol saturado	Invitrogen	15513-039	N / A
Cloroformo	JT Baker	9180-03	N / A
Acetato de sodio	JT Baker	3470-05	3 M de valores
Fast Green FCF	Fisher Biotecnología	BP123-10	10% de acciones
El alcohol isopropílico preparación	Tyco Healthcare	6918	N / A
30 de calibre de aguja	Terumo Medical Corp.	SG2-3013	N / A
Exmire microjeringa	Ito Corporación	MS * E05	N / A
Tweezertrode (electrodo pinza)	BTX instrumento, Genetronics Inc.	522	N / A
Electro Plaza del evaporador (electroporador)	BTX instrumento, Genetronics Inc.	ECM 830	N / A
Compuesto octubre	Sakura Finetek EE.UU.	4583	N / A