Bacterioplancton ambientales se incuban con un modelo del carbono orgánico disuelto (COD) y un reactivo compuesto de ADN de etiquetado, bromodesoxiuridina (BrdU). Después, DOC-degradantes células se separan de la comunidad a granel en base a su elevada incorporación de BrdU utilizando fluorescencia clasificación de células activadas (FACS). Estas células son identificadas por los posteriores análisis molecular.
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Artículo de método
Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los microbios son los principales agentes de mediación de la degradación de muchos de carbono orgánico disuelto (COD) sustratos en los ambientes acuáticos. Sin embargo, la identificación de los taxones de bacterias que transforman las piscinas específicas de DOC en la naturaleza supone un reto técnico.
A continuación se describe un enfoque que las parejas bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación, la fluorescencia de células activadas clasificación (FACS), y 16S ARNr de análisis basados en genes molecular que permite que la cultura independiente de la identificación de bacterioplancton capaces de degradar un compuesto DOC específicas en los ambientes acuáticos. Microcosmos por triplicado bacterioplancton están preparados para recibir tanto BrdU y un compuesto modelo DOC (DOC modificaciones), o sólo BrdU (sin adición de control). Sustitutos de BrdU las posiciones de la timidina en el ADN de nueva síntesis bacteriana y BrdU marcado de ADN puede ser fácilmente immunodetected 1,2. A través de una de 24 horas de incubación, bacterioplancton que son capaces de utilizar el compuesto añadido DOC se espera que se activan selectivamente, y por lo tanto, tienen mayores niveles de incorporación de BrdU (células HI) que no responde a las células en las enmiendas DOC y las células no- Además de los controles (bajo recuento de incorporación de BrdU, las células LI). Después de inmunodetección de fluorescencia, las células se distinguen HI y separadas físicamente de las células LI por clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) 3. Ordenado DOC-respuesta (células HI) se extraen de ADN y taxonómicamente identificados a través de 16S rRNA gen posterior análisis basados en PCR como, la construcción de la biblioteca y la secuencia de clon.
Protocolo
1. Procesamiento de las muestras de agua
- Filtro de 10 litros de agua del medio ambiente a través de un filtro de membrana micras de tamaño de poro para eliminar las partículas grandes y bacteriovores. Recoger el filtrado de agua en una garrafa.
- Transferencia de 36 ml de filtrado a cada uno en tres tubos estériles Eppendorf (50 ml) contiene 4 ml solución preparada recientemente paraformaldehído (PFA, el 10%). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente para preservar las células. Recoger las células en 0,22 micras de tamaño de poro de filtros de membrana blanco por filtración al vacío. Lave el filtro de paso de 10 ml de buffer fosfato salino (P....
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Discusión
Nuestras parejas enfoque BrdU incorporación, FACS y análisis de 16S ADNr para permitir que las especies a nivel de identificación de bacterioplancton que metabolizan los componentes individuales de DOC en los ambientes acuáticos. El ensayo de incorporación de BrdU etiquetas de las células bacterianas sobre la base de las actividades metabólicas, lo que permite el análisis sólo en las bacterias activas y por lo tanto no incluye a las células inactivas. En nuestro enfoque, la incorporación de BrdU se encuentra en.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
La financiación de este proyecto fue proporcionado por la National Science subvenciones OCE1029607 Foundation (XM) y MCB0702125 (de MAM) y Gordon y Betty Moore Foundation (de MAM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Nombre | Tipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| BrdU | Reactivo | Sigma | B5002-5G | |
| Lisozima | Reactivo | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinasa K | Reactivo | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ proliferación de células Kit, Fluos | Equipo | Roche | 11810740001 | Consumir más de Anti-BrdU-Fluos tampón de incubación y por la reacción que lo sugerido por el fabricante. |
| Sello marco de las cámaras de incubación | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Filtros de membrana de policarbonato (142 mm de diámetro, 1,0 m de tamaño de poro) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Filtros de membrana de policarbonato (25 mm de diámetro, 0,2 m de tamaño de poro) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| ilustración PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Equipo | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extracción kit | Equipo | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe de PCR System | Equipo | EPICENTRO | FS99060 |
Referencias
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J.
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Reimpresiones y permisos
