Summary
Microiontophoresis يستتبع حركة الأيونات من micropipette ردا على الفرق في الجهد الكهربائي بين داخل وخارج micropipette. وبذلك يتم تسليم الجزيئات النشطة بيولوجيا في نسبة إلى تيار كهربائي. نحن لتوضيح microiontophoresis أستيل بالتزامن مع المجهرية لدراسة البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية في دوران الأوعية الدقيقة.
Abstract
Microiontophoresis يستلزم مرور الحالي خلال قمة micropipette لتقديم المذاب في موقع معين ضمن إعداد التجريبية. ويمكن محاكاة Microiontophoresis انتقال متشابك 1 من خلال تقديم العصبية والخلايا العصبية على نيوروببتيد بتكاثر 2. حجم ضئيل (السائل) التشريد تتجنب الاضطرابات الميكانيكية في إعداد التجريبية. تكييف هذه التقنيات إلى دوران الأوعية الدقيقة 3 مكن أن تدرس آليات توسع الأوعية وتضيق الأوعية على المستوى المجهري 4،5 في الجسم الحي. والميزة الرئيسية لمثل هذا التسليم المترجمة تمكين ردود حركي لدراستها في مواقع محددة داخل الشبكة الاوعية الدموية الدقيقة من دون إثارة أو تغييرات منهجية انعكاسية في ضغط الدم والأنسجة تدفق الدم ، مما يكشف عن الخصائص الجوهرية للmicrovessels.
وجود قيود على microiontophoresis هو أن تركيز دقيق وكيل تسليمها إلى موقع الاهتمام من الصعب التأكد من 6. ومع ذلك ، فإن صدوره من طرف micropipette يتناسب مع كثافة ومدة طرد 2،7 الحالية ، يمكن أن تكرار مثل هذه الحوافز والاستجابة بسهولة تحديد العلاقات في ظل ظروف تجريبية محددة (موضح أدناه). عوامل إضافية تؤثر على تسليم microiontophoretic تشمل تركيز المذاب وتأين في الحل. وينبغي أن القطر الداخلي للطرف micropipette تكون ~ 1 ميكرون أو أقل لتقليل diffusional 'تسرب' ، والتي يمكن تصدى الحالي مع الاحتفاظ. وهكذا يتم استخدام الخارجي (إيجابية) الحالي لإخراج الموجبة والسلبية الحالية المستخدمة في الاحتفاظ بها داخل micropipette.
ومما يسهل تلفيق micropipettes مع جر إلكترونية متطورة 8. يتم سحبها من Micropipettes أنابيب زجاجية تحتوي على خيوط شعري أن "فتائل" الحل في غيض من micropipette عندما شغله من النهاية الخلفية ("ردم"). يتم ذلك عن طريق إدخال أنبوب microcapillary متصلة حقنة تحتوي على محلول من الاهتمام وإخراج الحل في لمعة من micropipette. Micromanipulators تمكين الموضع المطلوب من خلال إعداد micropipettes التجريبية. يمكن وضعه Micromanipulators التي شنت على قاعدة متحركة حول إعداد وفقا لتضاريس شبكات الاوعية الدموية الدقيقة (المتقدمة أدناه).
ويوضح البروتوكول microiontophoresis للأستيل كولين (ACH + CL --) على شرين an عضلة الماوس إعداد المشمرة (انظر المرتبطة بروتوكول : إن الرب رقم # 2874) لإنتاج البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية. يتزامن التسليم مع التحفيز الحصول على الصور الرقمية باستخدام الزناد الالكترونية. استخدام BAC - GCaMP2 Cx40 9 الفئران المعدلة وراثيا يمكن تصور ردود الكالسيوم داخل الخلايا الكامنة في توسع الأوعية تصلب الخلايا البطانية في دوران الأوعية الدقيقة الحية.
Protocol
1. رعاية الحيوان واستخدام
بعد مراجعتها والموافقة عليها من رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم اللجنة ، وتستخدم الفئران الذكور لا يقل عن 12 أسابيع من العمر. فأر هو تخدير بنتوباربيتال مع الصوديوم (60 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن (IP) داخل الصفاق. في جميع أنحاء العمليات الجراحية التجريبية والبروتوكولات ، يتم الاحتفاظ التخدير بواسطة ملاحق (10-20 ٪ من الحقن الأولى ، IP) حسب الحاجة (كل دقيقة 30-60 ، وأشار ، ردا الانسحاب إلى أخمص القدمين أو قرصة الذيل). بعد الانتهاء من إجراء التجارب هو جرعة زائدة من الفأر مع بنتوباربيتال (IP) ، والموت الرحيم بواسطة الخلع عنق الرحم.
2. وMicropipettes Microiontophoresis
- مستعدون micropipettes Microiontophoresis (الداخلية القطر تلميح ، ~ 1 ميكرون) من أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية باستخدام ماصة مجتذب الأفقي. بلدنا يملك ~ تفتق 5 مم لصلابة ؛ يعد التناقص التدريجي أكثر مرونة.
- يتم ردم Micropipettes مع أدن تشافيز 1M (Figure1A - C) الذائب في الماء 18.2 MΩ. لردمها ، يتم توصيل أنبوب microcapillary لتصفية 0.2 ميكرومتر بالإضافة إلى حقنة تحتوي على ناهض الفائدة (الشكل 1). يمكن أن تكون هذه ملفقة بسهولة (أدناه) ، أو تم شراؤها من الباعة التجاريين. يتم إدخال الأنبوب في نهاية microcapillary الخلفي من يتم تسليم الحل micropipette وأدن تشافيز في التجويف بينما سحب أنبوب microcapillary كما micropipette يملأ. عقد micropipette مع طرفها مشيرا إلى الأسفل ، يتم إزالة فقاعات الهواء عن طريق التحريك بلطف micropipette.
- يتم تأمين micropipette في حامل محمل في micromanipulator (الشكل 2). حامل فضية وسلك ربط الحل أدن تشافيز داخل micropipette إلى دبوس الخارجية ، التي هي بدورها مرتبطة الموجب لمبرمجا microiontophoresis. تم توصيل سلك من الفضة second المضمون على حافة إعداد الأنسجة إلى السالب لاستكمال الدائرة المتقدمة كما هو غيض من micropipette الى الحل ملحي الفسيولوجية خلال التحضير.
- ويطبق الحالية في الابقاء على منع توسع الأوعية (أو استجابة الفلورية) عندما يتم وضع الطرف micropipette المحاذية للجدار تصلب. وسوف تحتفظ الحالية تختلف مع حجم رأس micropipette (القطر الداخلي = 1 ميكرون) ، ولكن تركيز استنساخه ناهض للغاية لمعايير محددة (نستخدم ~ 200 غ لأدن تشافيز 1M ، 1 غيض ميكرومتر). ويتوقف الاحتفاظ الحالية تتزامن مع تسليم طرد الحالي عن طريق تحريك الإلكترونية (الشكل التكميلي 1) تزامن مع بداية الحصول على الصور.
3. المجهرية
- كانت ملفقة منصة مخصصة لمرحلة المجهر XY من الفولاذ المقاوم للصدأ المغناطيسية. أبعاد المنصة (1 / 8 "X 12" X 13 ") تتيح مساحة كافية لmicromanipulators الموقف حول إعداد التجريبية كما Micromanipulators المطلوب (الشكل 2A). المضمون قواعد المغناطيسي (الشكل 2B) تمكين لتحديد المواقع وفقا لما تمليه التحضير ، وهذه هي وضعها مباشرة على منصة ملفقة حول التحضير لmicropipettes المواقع في المواقع المهمة (الشكل 2C).
4. ممثل النتائج
- مع طرف micropipette المتمركزة المتاخمة لشرين ، هناك استجابة لمضان أدن تشافيز (الاحتفاظ الحالي من تعديلها لمنع تسرب أدن تشافيز). تحت عتبة حافزا كان هناك أي تأثير. ومع ذلك ، وزيادة الكالسيوم الخلية البطانية مضان كما زادت كثافة التحفيز ، عبر مسافات أكبر تدريجيا على طول شرين ، وكذلك كثافة مضان في موقع التحفيز (الشكل 3).
الشكل 1. طريقة لردم الماصات Microiontophoresis. أ) يتم تأمين أنبوب microcapillary (السهم الأخضر) في تركيب ضغط (السهم الأزرق) موصولة إلى 0.2 ميكرون فلتر (السهم الأرجواني) الذي يعلق بعد ذلك إلى حقنة مليئة أدن تشافيز 1M. B) أنبوب microcapillary وتغذي غير ماصة المشردين microiontophoresis حتى نهاية الظهر والحل لملء التجويف من micropipette جيم) حالما يتم تعبئة ماصة ، وعقد قمة لأسفل ونفض الغبار برفق فوق تفتق لإزالة الفقاعات (السهم الأسود).
الشكل 2. منهاج مخصص Micromanipulator الموضع. .. A) وضعت منصة المغناطيسية والفولاذ المقاوم للصدأ على قاعدة العرف المجهر MVX10 تتضمن المرحلة XY متعدية ب) قواعد المغناطيسي التعميم الملصقة على الجزء السفلي من micromanipulators من 3 محاور المدمجة C) Micromanipulators المتمركزة حول إعداد التجريبية (انظر بروتوكول المرتبطة بها : إن الرب رقم # 2874) لدراسة مواقع محددة من الاهتمام. والأشعة تحت الحمراء مدمجة الحجم والتنوع يمكن أن تستخدم micropipettes متعددة في وقت واحد.
الشكل 3. الكالسيوم في الشرايين الإسفار. مضان زيادة الكالسيوم في الخلايا البطانية المبطنة للجدار مع شدة تصلب التحفيز. أول 3 لوحات لوحات معروضة للردود مضان إلى A) 250 B ، NA) 500 غ و C) 1000 NA طرد الحالية (500 مللي كل نبضة مدة). يشار إلى أن المسافة التي البطانية مضان الكالسيوم بنسبة خلية في ميلانو بين قوسين (~ 130 ، 270 و 400 ميكرون ، على التوالي). خط المرجعية عبر شرين في كل لوحة تشير إلى حيث سجلت ردود مضان (F / FO) لأدن تشافيز في موقع التحفيز. D) تسجيلات من الوقت مقابل F / FO لزيادة المحفزات أدن تشافيز. كما طرد الحالي زيادة ، وزيادة F / FO في السعة والمدة. علما أن 100 NA التحفيز كانت أقل من الحد الأدنى وليس لها أي تأثير.
الشكل 1 التكميلية. مخطط الرسم البياني لالزناد الإلكترونية. هذه الدائرة هي تفاعل مع المنفذ المتوازي من جهاز كمبيوتر شخصي. عند تنشيطه يوفر ثابت TTL نبض 5V. رقاقة 7805 هو الجهد المنظم 5V موصلة بمصدر 9 - 12V العاصمة السلطة (بطارية من الجهد المناسب على ما يرام). الإخراج من 7805 يوفر القدرة على تبديل الثنائية رباعية والإخراج من الدائرة. المدخلات عبر المقاوم هو 1K من الكمبيوتر.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوضح الأساليب لإعداد وتنفيذ micropipettes لmicroiontophoresis. يستخدم تسليم أستيل لتوضيح الإشارات الكامنة الكالسيوم البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية في الشرايين من الفأرة تخدير. نتائجنا توضح أن المسافة التي أدن تشافيز زيادات الزيادات مضان الخلية البطانية الكالسيوم مع كثافة طرد الحالي من micropipette microiontophoresis (الشكل 3). عدم وجود زيادة في ظل ظروف يستريح مضان يشير ضئيلة من التسرب من micropipette أدن تشافيز. عدم استجابة إلى 100 كثافة التحفيز NA (الشكل 3 ، أسطورة) يوضح أن هناك حاجة إلى كثافة عتبة تحفيز الخلايا البطانية للكالسيوم في الزيادة. هذه التقنيات يمكن تكييفه بسهولة لعوامل أخرى والاستعدادات فعال في الأوعية الأنسجة.
الاعتبارات العملية : في العمل مع microiontophoresis لدراسة التفاعلات شريني ، ينبغي الاعتراف بها العديد من الأشياء. في حين أنه قد ثبت من الصعب تحديد تركيز ناهض الفعلي للتسليم ، التحفيز على الاستجابة المنحنيات واستنساخه داخل وبين الاستعدادات. لا يمكن أن يؤديها من خلال عقد هذه المدة نبض ثابت (على سبيل المثال ، 500 مللي ثانية) ، وطرد متفاوتة الحالية (على سبيل المثال ، 250 ، 500 و 1000 NA ؛ الشكل 3). بدلا من ذلك ، يمكن عقد قذف تيار مستمر (على سبيل المثال ، 500 غ) ، ومدة نبض متنوعة (على سبيل المثال ، 250 ، 500 و MS 1000) للإشارة إلى إجراءات محددة تركيز ناهض ، يمكن إعداد superfused مع الحل المناسب 5. لأن القوة الدافعة للطرد المذاب هو اتهام الحركة الكهربائية ، يجب على الوكيل أن يتم تسليم تحمل شحنة الصافية إلى أن النازحين من micropipette. للتأكد من أن وكيل لمصلحة الناقل هو المسؤول الأساسي ، يتم حله في تركيز عال (على سبيل المثال ، 1 م لACH) للحد من التناضح الكهربائية. عندما يتطلب هذا التلاعب في الرقم الهيدروجيني للmicropipette حل التعبئة والضوابط اللازمة للتأكد من المركبات أي تأثيرات غير محددة. وينبغي أيضا أن يتم تنفيذ الضوابط المناسبة لمرور الحالية وحدها (على سبيل المثال ، باستخدام micropipettes مليئة المالحة متساوي التوتر). وينبغي أن المسافة الفعالة لنشر وكيل من موقعه الإفراج يجب التثبت منها والأكثر بسهولة تحديد تجريبيا قبل اختفاء الاستجابة الفسيولوجية (على سبيل المثال ، توسع الأوعية أو ارتفاع في الكالسيوم داخل الخلايا على طرد ACH) حيث يتم وضع في micropipette مسافات محددة من الموقع المستهدف. في الممارسة العملية ، ويتأثر كثيرا المسافة نشر فعالة من قبل كيف يتم وضع غيض من micropipette في الأنسجة ، على سبيل المثال إذا المغطي غيض الضغط إلى أسفل داخل الأنسجة وطرفها ، مما هو ضعف الإخراج. النسيج الضام المفرط مزعجة للغاية وينبغي إزالتها من سطح الأنسجة أثناء إعداد الجراحية. كما ينبغي إيلاء الاهتمام لإمكانية أوزون غيض من الوكيل المعين. تم تصغير هذه باستخدام نبضات قصيرة نسبيا (على سبيل المثال ، ≤ 1 ق). مع التيارات مستمرة (على سبيل المثال ، عدة ثوان) ، قد يكون طرد من طرف ناهض بسرعة أكبر مما يمكن استبداله نشر الجزء الأكبر من الحل في ملء micropipette.
لأن المشردين حجم ضئيل مع microiontophoresis ، إذا واحد هو محاولة لتغيير بيئة المحلية الأيونية (على سبيل المثال ، لتقديم K depolarizing + الحوافز) ، فإن هذا لا يتحقق على نحو فعال مع microiontophoresis لكن يتحقق بسهولة مع طرد ضغط السوائل السائبة وجود المطلوب التكوين. لتحفيز المحلي لشرين ، نصائح micropipette بأقطار داخلية من 2-3 ميكرون تعمل بشكل جيد مع الضغوط طرد 4-5 رطل (28-35 كيلو باسكال) ومدة النبضة (على سبيل المثال ، 1 ثانية) التي تسيطر عليها مع صمام الملف اللولبي 10. حيث يتم تسليم المطلوب مستمرة من وكيل micropipette من الصعود إلى microvessel ، يفضل الضغط قذف به micropipettes المناسبة قطر الحافة الداخلية (على سبيل المثال ، ~ 10 ميكرون) 11،12. عمود الهيدروستاتي من ارتفاع معروفة مع صمام محبس يوفر غير مكلفة ، واضحة المعالم على / قبالة رأس الضغط المستمر. ويتم تحديد معدلات التدفق القطر الداخلي للطرف ماصة والضغوط الدافعة. كما هو الحال دائما ، والضوابط مركبة ضرورية لاستبعاد الإجراءات غير محدد من طرد الضغط.
Disclosures
تمت الموافقة على كافة الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان ، واستخدم من جامعة ميسوري والتي أجريت في الاتفاق مع المرشد لمعاهد الصحة الوطنية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. رعاها الإنتاج من هذه المادة الضوئيات ستانفورد.
Acknowledgments
ويدعم البحوث في المختبر المؤلفين من المعاهد الوطنية للصحة منح R37 - HL041026 ، R01 - R01 HL086483 وHL056786 - (SSS) وHL097463 - F32 و- T32 AR048523 (PB) من خدمة الولايات المتحدة الصحة العامة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
| 0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
| 5 ml syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
| 3-axis micromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
| microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
| stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | According to design |
| Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
