Se presenta el protocolo detallado para la mediada por Agrobacterium inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) de ensayo en el algodón. El virus del cascabel del tabaco (TRV) vectores derivados de VIGS fueron desplegados para inducir el silenciamiento de ARN de algodón GrCLA1, Alterados Cloroplastos un gen. El fenotipo albino causadas por el silenciamiento GrCLA1 se observó en el estado de plántula dentro de 2 semanas después de la inoculación.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón
En este artículo
Resumen
Resumen
Algodón (Gossypium hirsutum) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Los esfuerzos se han hecho considerables en la reproducción molecular de nuevas variedades. El análisis genético a gran escala funcional de algodón se ha quedado atrás la mayor parte de las especies de plantas modernas, probablemente debido a su gran tamaño de la duplicación del genoma, los genes y la poliploidía, largo ciclo de crecimiento y la obstinación a la transformación genética 1. Para facilitar el estudio funcional de alto rendimiento genética / genómica en algodón, tratamos de desarrollar ensayos transitoria rápida y eficiente para evaluar las funciones de genes de algodón.
Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es una poderosa técnica que fue desarrollada con base en el host post-transcripcional silenciamiento génico (PTGS) para reprimir la proliferación viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS ha sido aplicado con éxito en una amplia gama de especies dicotiledóneas como Solanaceae, Arabidopsis y otras especies de leguminosas y especies monocotiledóneas como la cebada, el trigo y el maíz, por diversos estudios de genómica funcional 3,4. Como este método rápido y eficaz evita la transformación de plantas y supera la redundancia funcional, es particularmente atractiva y adecuada para el estudio de genómica funcional en las especies de cultivos como el algodón no es susceptible de transformación.
En este estudio, se presenta el protocolo detallado de Agrobacterium VIGS sistema en el algodón. Entre los varios vectores VIGS viral, el virus del cascabel del tabaco (TRV) invade una amplia gama de huéspedes y es capaz de propagarse con fuerza a lo largo de toda la planta sin embargo, producen síntomas leves en la hosts5. Para controlar la eficacia de silenciamiento, GrCLA1, un gen homólogo de Arabidopsis Cloroplastos Alterados un gen (AtCLA1) en el algodón, ha sido clonado y se inserta en el vector binario VIGS pYL156. CLA1 gen está involucrado en el desarrollo del cloroplasto 6, y estudios previos han demostrado que pérdida de función de AtCLA1 dio lugar a un fenotipo albino de 7 hojas verdaderas, proporcionando un excelente marcador visual para silenciar la eficiencia. En aproximadamente dos semanas después de la infiltración de Agrobacterium, el fenotipo albino comenzaron a aparecer en las hojas verdaderas, con una eficiencia del 100% en silenciar a todos los experimentos replicados. El silenciamiento de la expresión de genes endógenos también fue confirmado por RT-PCR análisis. Significativamente, el silenciamiento potente podría ocurrir en todas las variedades que hemos probado, incluyendo varias variedades cultivadas comercialmente en Texas. Esta rápida y eficiente mediada por Agrobacterium VIGS ensayo proporciona una herramienta muy poderosa para un rápido análisis a gran escala de las funciones de los genes en el genoma de nivel en el algodón.
Protocolo
1. Crecer las plántulas de algodón
- Sembrar las semillas del algodón (Gossypium hirsutum) variedad FiberMax 832, Phytogen 425RF, 480WR Phytogen y Deltapine 90 en macetas (7 cm de diámetro) que contienen la mezcla Metro 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Mantenga los recipientes en una bandeja cubierta con una cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S -1 luz, con un fotoperíodo de 12 horas light/12 horas oscuras en una sala de crecimiento.
- Retire la terminal cuando dos cotiledones han surgido.
- Aproximadamente dos semanas después, el uso de las plantas con dos cotiledones completamente abiertos para el ensayo de VIG....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
VIGS ha demostrado ser una poderosa herramienta en el análisis de la genómica funcional de forma transitoria derribar la expresión de genes endógenos. En este estudio, hemos desarrollado un VIGS mediada por Agrobacterium mediante la utilización de un vector binario TRV-basado. El algodón CLA1 (GrCLA1) gen fue desarrollado como una marca visual para monitorear la eficiencia de silenciamiento. Siempre hemos obtenido el 100% de eficiencia de silenciamiento génico, como lo demuestra el fenotipo albino que aparecen .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a los Dres. SP Dinesh-Kumar y Liu Yule para TRV-VIGS vectores, y los Dres. Chuck Kenerley, Wheeler Terry, Starr y Jim Bayer CropScience para el suministro de semillas de algodón. Este trabajo fue financiado por la NSF para LS y los NIH para PH
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de los reactivos y equipos | Empresa | Catálogo / número de serie | Comentarios |
| Rodillos de tambor | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacteria cultura |
| Incubadora | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacteria cultura |
| UV / Vis espectrofotómetro | Beckman Coulter | Modelo: DU530 | La medición de OD |
| Gene Emisores | BioRad | Modelo: 1652076, de serie: 154BR3880 | Electroporación |
| Generador de impulsos del controlador | BioRad | Modelo: 1652098, de serie: 232BR4833 | Electroporación |
| Micropulser cubeta de electroporación | BioRad | 165-2081 | Electroporación |
| 1 ml jeringa | BD Biosciences | 30962 | La inoculación de las agro-bacteria |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU # 553001 | Plántulas de crecimiento |
| Terra Cotta olla | TOPlastics | GPS 3001B2 | Plántulas de crecimiento |
| MES monohidrato | USB | 18886 | La infiltración de búfer |
| Acetosiringona | Sigma | D134406 | La infiltración de búfer |
Referencias
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
