Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Resumen

Se presenta una técnica de lentivirus de la manipulación genética y la visualización de un solo axón neuronas sensoriales olfativas y su arborización terminal de In vivo.

Resumen

Desarrollo de un circuito olfativo precisa se basa en la proyección exacta de las neuronas sensoriales olfativas (OSN), los axones hacia sus objetivos sináptica en el bulbo olfatorio (OB). Los mecanismos moleculares de la OSN crecimiento de los axones y la selección no se comprenden bien. Manipulación de la expresión génica y posterior visualización de los axones OSN único y su morfología terminal de jardín hasta el momento han sido todo un desafío. Para estudiar la función génica en el nivel de células individuales dentro de un plazo determinado, hemos desarrollado una técnica basada en lentiviral para manipular la expresión génica en OSN en vivo. Partículas lentiviral se entregan a OSN por microinyección en el epitelio olfatorio (EO). Casetes de expresión de forma permanente se integra en el genoma de la OSN transducidas. Expresión de la proteína fluorescente verde identifica OSN infectados y describe su morfología completa, incluido el jardín axón terminal. Debido a los plazos de entrega cortos entre la microinyección y la detección de periodista, los estudios de la función genética se puede enfocar en un plazo muy limitado de desarrollo. Con este método, se ha detectado la expresión de GFP en tan sólo tres días y hasta tres meses después de la inyección. Hemos logrado por la sobre-expresión y del shRNA mediada por knock-down por microinyección lentiviral. Este método proporciona morfologías detallada de los cuerpos celulares y axones OSN en el nivel de células individuales en vivo, y por lo tanto permite la caracterización de la función de genes candidatos durante el desarrollo del olfato.

Protocolo

1. Preparación

Este procedimiento es la bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, todos los preparativos se hacen las siguientes en una campana de riesgo biológico donde se realiza el procedimiento de microinyección.

1. Preparar y precalentamiento a 37 ° C cama de agua: Llene una bolsa de plástico con agua - sello y situado en un bloque vacío de calefacción incubadora. Esto permitirá que los ratones a recuperarse después de la inyección.
2. Llenar un recipiente para residuos biológicos peligrosos con lejía al 10% a un volumen adecuado para la inmersión de todos los residuos de este procedimiento.
3. Prepare un plato pequeño abierto de etanol al 70% y un segundo plato con ddH2O esterilizado y el lugar en el gabinete de seguridad biológica.
4. Esterilizar una capacidad 5μL jeringa Hamilton con una aguja de calibre 33 rociando el cuerpo y la aguja con el 70% de etanol con el émbolo se retiró todo el camino. Repetidamente aspirado etanol a partir de la antena y expulsar todo el camino por lo menos 5 veces.
5. Enjuague el cartucho de la jeringa con agua estéril de aspiración y extracción de al menos 5 veces. Coloque la jeringa de forma segura a un lado de la campana de la cultura y deje que se seque.
6. Eliminar los stocks de virus de -80 ° C y almacenamiento en el congelador en lugar de hielo para permitir la descongelación. Microinyección requiere 2μL del stock de virus por ratón con un título de 10 ⁹ unidades infecciosas / ml. Los lentivirus se puede obtener de fuentes comerciales o producidos en el laboratorio de acuerdo con el protocolo establecido (Lois et al., 2002).
7. Prepare una etapa de inyección que proporciona una zona elevada por encima de la superficie de la campana - puede utilizar una placa de cultivo de 10 cm cubierto con una sábana de Kimwipe.
8. Organizar toallitas con alcohol cerca de la estación de inyección.

2. Microinyección de partículas lentiviral en el epitelio olfatorio

Todos los procedimientos de animales que hayan realizado en este método se realiza de acuerdo con las directrices aprobadas IACUC. El Mus musculus cepa C57BL/6J es el modelo animal utilizado en todos los experimentos se demuestra aquí.

1. Anestesiar a crías de ratón por la hipotermia, a una cría de ratón (P0-P3) fuera de la jaula y poner el cachorro en un guante de corte abierto en el hielo durante 5 minutos.
2. A la espera de que el cachorro a estar completamente anestesiado, 2μL aspirado de las acciones virales en el esterilizado jeringa Hamilton.
3. Coloque la cría de ratón en la parte superior de la fase de inyección. Tire suavemente de la piel lejos de la parte superior de la cabeza en el oído hacia la parte superior del cuello. Esto debería proporcionar una superficie de la piel impartidas a través de la cavidad nasal y la facilidad de la inyección.
4. Inserte la aguja a través de la parte superior de la cavidad nasal de aproximadamente 3 mm por debajo de la superficie de la piel para alcanzar el epitelio olfativo. Microinject 0.5μL de la solución de virus por disparo, la elección de dos sitios por cada lado, izquierdo y derecho (cuatro inyecciones total por ratón = 2μL de virus es necesario). Los puntos de inyección deben ser escalonadas separados unos de otros. Para la selección de los sitios de inyección adecuada, buscar en la superficie del cráneo dorsal para el contorno del bulbo olfatorio. Esta línea es apenas visible en el nacimiento a través de la piel semi-transparente y el cráneo. Para que dos inyecciones por cada lado, el objetivo de una inyección justo rostral al bulbo de un esquema en un eje medial. Hacer la segunda inserción lateral al contorno del bulbo, sin embargo, asegúrese de que el ángulo de la inyección medial de modo que usted puede alcanzar el epitelio olfativo que se encuentra debajo de la parte ventral del bulbo. Evitar penetrar en el bulbo olfatorio!
5. Seque cualquier solución de virus o de la sangre residual que puede escapar de la zona de inyección o aberturas ventana de la nariz con un Kimwipe. Deseche inmediatamente Kimwipes en el recipiente de líquido blanqueador diluido riesgo biológico.
6. Coloque el ratón inyectado en la cama de agua incubadora.
7. Repita los pasos 1-4 para todos los ratones que se inyecta, recordando que se necesitan alrededor de 2μL del stock de virus por ratón.
8. Vamos a recuperar los ratones en la cama de agua incubadora durante 30 minutos antes de volver a su jaula de anidación original.
9. Disponer de la etapa de la microinyección, toallitas desinfectantes y productos de limpieza adicional de papel en la eliminación de cloro líquido de riesgo biológico.
10. Limpie la jeringa Hamilton por la aspiración repetida y la expulsión de etanol y agua como se hizo en los pasos de preparación. Dejar que la jeringa que se seque.
11. Para máxima eficiencia de transducción repetir de nuevo este procedimiento en 4 horas. OSN infectada puede ser visualizado a lo largo de la célula en tan sólo tres días.

3. Inmunohistoquímica de secciones flotantes bulbo olfatorio

1. El sacrificio del ratón inyectado en el punto en el tiempo deseado y fijar la perfusión del tejido con paraformaldehído al 4%. Diseccionar el OB. Incubar en paraformaldehído durante la noche y del 30% de sacarosa en PBS durante la noche. Insertar en el medio de inclusión octubre en hielo seco.
2. Coronal secciones OB se obtienen en un 60μm de espesor con un criostato. Barrido secciones bombilla en una placa de cultivo de 10 cm con 5 ml de PBS 1x (pH 7,4). Las secciones deben mantenerse flotando en PBS para permitir a octubre dissolve. Transferencia de las secciones flotantes y PBS en un vial de 50 ml cónicos.
3. Permitir que las secciones que se depositan en el fondo del vial. Vacío de PBS sin aspirar a ninguna de las secciones. Enjuague las secciones de tejido con 20 ml de PBS. Repita los pasos asentarse y pasar la aspiradora. Tejido resuspender con 10 ml de PBS y las secciones de transferencia flotante a un vial de 15 ml cónicos de inmunotinción. Una vez que las secciones de tejido se han asentado, el vacío de PBS sobrenadante sin alterar los tejidos. Volver a suspender las secciones con el 0,3% Triton X-100 en 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) que permite detergente para perforar las membranas celulares. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y repetir la incubación con PBS-Tx dos veces.
4. Incubar las secciones de tejido en 10 ml de solución de bloqueo (5% suero de caballo en PBS-Tx) durante dos horas a temperatura ambiente.
5. Enjuague la solución de bloqueo por lo menos dos veces con PBS-Tx durante 15 minutos cada una a temperatura ambiente.
6. Prepare 2 ml de una solución de anticuerpo primario en PBS-Tx. Vea la sección de Reactivos y Equipos para los anticuerpos utilizados en este experimento.
7. Vuelva a colocar segundo PBS-Tx lavado de bloqueo con la solución de anticuerpo primario. Incubar en una plataforma lenta oscilación (~ 30rpm) a 4 ° C durante 24-48 horas para asegurar la penetración a fondo de las secciones flotantes 60μm.
8. Después de la incubación, la solución de anticuerpo primario puede ser recuperada cuidadosamente con una pipeta y se almacenan a 4 ° C para su reutilización hasta dos veces más dentro de dos semanas sin una pérdida significativa de la intensidad de la tinción.
9. Lávese las secciones tres veces en PBS-Tx durante 20 minutos cada una a temperatura ambiente con una rotación suave (~ 30rpm).
10. Prepare 2 ml de la dilución del anticuerpo secundario en PBS-Tx. Aspire el último lavado y agregar la solución de anticuerpo secundario a las secciones de tejido. Envuelva el exterior de la cubeta de tinción en papel de aluminio para bloquear la luz, que puede causar photobleaching fluoróforo. Lugar envuelto en una plataforma vial lentamente balanceándose e incubar a 4 ° C durante la noche.
11. Desechar la solución secundaria de anticuerpos con la aspiradora de distancia. Lávese las secciones de una vez con PBS-Tx durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces más con PBS (pH 7,4) durante 20 minutos cada una a temperatura ambiente. Montaje de las secciones de tejidos teñidos en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G.
12. Pantalla a través de las secciones teñidas positivamente para los axones OSN infectados y terminales de axón con un microscopio de fluorescencia.
13. Para construir una visión tridimensional de una etiqueta axón OSN y cenador terminal, hacer una serie de secciones ópticas a través de la profundidad de 60μm de la división de destino tejido OB (a lo largo del eje z) mediante microscopía confocal.
14. Esta pila de sección Z imágenes posteriormente se pueden proyectar juntos para reconstruir una perspectiva de 360 ​​º de rotación de una sola etiqueta axón OSN, incluyendo terminales de detalle jardín en su totalidad. Cualquier ángulo de rotación de una sola puede ser capturado y exportado como un archivo de imagen (es decir, JPG, TIFF) para su presentación en formato 2D.

4. Resultados representante

Con los métodos descritos aquí, podemos transducir neuronas sensoriales olfativas por lentivirus en vivo. De esta manera hemos OSN infectados ahora visualiza con las buenas prácticas agrarias y los periodistas mCherry fluorescentes, así como con un myc-etiquetados proteína de fusión a través de inmunocitoquímica. Esta técnica proporciona una abundancia de OSN infectados. Sin embargo, la transducción se presenta esporádicamente suficiente para proporcionar OSN etiquetados individualmente, lo que permite el análisis de la morfología de las células individuales. Axones y terminales de los axones son expuestas en las secciones de tejido OB en medio de su ambiente natural por microscopía confocal (Figura 1). Toda la OSN axón terminal jardín típicamente puede ser cautivado dentro de una sección óptica de 40-50 micras. Gran aumento de infectados terminales de los axones OSN permite un análisis detallado de la morfología axonal árbol en la capa glomerular.

Figura 1. Trayectoria de una sola neurona olfativa sensorial axón y su terminal de árbol. A) una sección coronal del bulbo olfativo de un ratón P7 que muestra la capa del nervio olfatorio (ONL) immunostained de OMP (rojo) y la capa glomerular (GL) immunostained con ambas OMP y Vglut2 (gris). Un solo axón olfatorio neuronas sensoriales que expresan GFP (verde) se mueve dentro de la ONL y penetra en la estructura glomerular. B) El axón terminal de la morfología de jardín dentro del glomérulo claramente de manifiesto en la expresión de GFP. Vglut2 co-tinción de color gris ilumina la superficie total glomular en el que la GFP-positivas axones elabora un aborto terminal. C) lentivirales OSN infectadas que expresan GFP (verde) en el entorno operativo. El cytostructure del epitelio olfativo se muestra con DAPI (azul). La expresión de GFP permite la visualización de los cuerpos celulares de OSN y sus procesos celulares en el entorno operativo. D) Un axón OSN y su morfología terminal con Rap1GAP2 expresión derribo por shRNA. Los lentivirus llevar un cassette de expresión con doble Rap1GAP2 ARNhc bajo el promotor del ratón U6 y las buenas prácticas agrarias con unPromotor de CMV se aplicaron a la OE. Infectados terminales de los axones olfativos exhibió un terminal más simple glorieta en comparación con la del control de las buenas prácticas agrarias solamente. Bar = 20μm.

Discusión

Microinyección de lentivirus resultados en la transferencia permanente de construcciones de genes en el ADN genómico OSN. Este enfoque nos permite realizar manipulaciones a corto plazo oa largo plazo de genes candidatos a través de la sobreexpresión o mediados del shRNA knock-down. Además, se pueden etiquetar con fluorescencia OSN solo en una línea de ratones transgénicos existentes para observar la co-localización de las poblaciones de receptores odoríferos. Microinyección es necesaria para la transducción lentiviral d...

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