Extracción de riñón intacto de ratón: una técnica para obtener riñón sin cápsula renal a partir de modelos murinos

Resumen

Fuente: Grainger, N. et al. Aislar e Imagen de Regiones de Marcapasos Vivas e Intactas de la Pelvis Renal de Ratón mediante Seccionamiento de Vibratome. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, describimos el procedimiento para la extracción de riñón del espacio retroperitoneal del ratón. El riñón extraído se puede microdiseccionar para obtener un riñón intacto sin una cápsula renal y la capa de grasa circundante.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disección de riñón

1. Anestesiar a los ratones mediante la inhalación de isoflurano al 3-4% en una capucha ventilada. Confirmar la inducción de la anestesia profunda por pérdida del reflejo de pinzamiento del dedo del pie y/o de la cola y luego sacrificar a los ratones por luxación cervical.
2. Aplique etanol al 70% en el pecho para humedecer el pelaje. Con unas tijeras de disección externas, abra la cavidad abdominal a través de una incisión longitudinal, con las hojas de las tijeras en ángulo alejado del animal para evitar daños en los órganos internos.
3. Con pinzas de tejido interno y tijeras de disección internas, pellizque los intestinos y levántelos lejos de la pared abdominal. Al levantar los intestinos, corte la parte inferior de los intestinos para liberarla del cuerpo en el duodeno proximal y el colon distal para acceder al espacio retroperitoneal que contiene los riñones.
4. Una vez que los riñones estén expuestos, extráigalos individualmente. Pellizque suavemente y levante el extremo distal del uréter (a ~ 4 mm del riñón) con pinzas de tejido. Con las tijeras de disección, corte por debajo del uréter pellizcado hacia el riñón. Continúe cortando por debajo del riñón hasta que se libere del tejido conectivo circundante.
   nota: Para maximizar la integridad del tejido y la consistencia del corte durante el corte del vibrátomo, el riñón debe estar lo más intacto posible. Para asegurar esto, evite pellizcar o cortar el riñón con fórceps y tijeras de disección.
5. Coloque el riñón con el uréter adjunto en una solución helada de KRB. Repita los pasos de extracción con el riñón contralateral para extraerlo del cuerpo del ratón. Mantenga los riñones en solución de KRB en hielo.
   NOTA: Proceda inmediatamente a la siguiente sección del protocolo para preservar la viabilidad del tejido PKJ. Debido a su localización anatómica profunda en el parénquima renal, la PKJ se ve privada del contacto con la solución de KRB.

>2. Prepare el riñón sin cápsula renal para el corte de vibratomo

1. Transfiera el riñón a una placa de disección recubierta de elastómero de silicona (60 mm x 15 mm) y llénela con una solución helada de KRB hasta que el riñón esté completamente sumergido.
2. Bajo un microscopio de disección, ancle el riñón a la base de la placa insertando clavos minuciosos en el uréter proximal y a través de la cápsula renal anterior delgada o el tejido adiposo circundante><. nota: Tenga cuidado de no perforar el tejido del parénquima renal.
3. Utilice unas tijeras de resorte finas y pinzas internas para extraer el tejido adiposo de la base del riñón y exponer el PR distal y el uréter proximal.
4. Retire el uréter proximal y una parte del PR distal de la base del PR con unas tijeras de resorte finas.
   nota: Tenga cuidado de no cortar el parénquima renal circundante. La línea discontinua negra en la Figura 1A indica la posición aproximada de este corte. Este corte crea una base plana en el riñón para una sección más uniforme del tejido. Al diseccionar el riñón, se debe tener en cuenta la posición anatómica de la región PKJ. La figura 1B muestra que el riñón intacto se puede cortar a lo largo de un plano sagital para exponer la médula, la papila (médula distal donde convergen los conductos colectores) y la RP proximal y distal. Si la papila se expusiera completamente, como en la Figura 1C, se puede visualizar la PKJ y la RP proximal (PR proximal). Sin embargo, esto no debe hacerse para la técnica del vibratomo; esta descripción es para orientar al lector a la ubicación de PKJ en general, enfatizada en la diferencia anatómica que se muestra en las imágenes de luz transmitida de la región PKJ y la región RP media en la Figura 1D, E.
5. Perfore la cápsula renal externa con pinzas de punta fina, inclinando las puntas lejos del cuerpo del riñón. Con pinzas con cada mano, pellizque los extremos sueltos de la cápsula y sepárelos. Continúe despegando la membrana restante de la cápsula renal hasta que se retire por completo.
   nota: La cápsula renal es una capa dura y fibrosa que rodea el riñón. Debe retirarse antes del corte del vibratomo para un corte óptimo.

Resultados

Figura 1: Anatomía básica del riñón y localización de la región del marcapasos PKJ.(A) Diagrama del riñón intacto que muestra la orientación del PR y el uréter. La arteria renal y la vena renal se muestran en rojo y azul, respectivamente. (B) El riñón intacto se puede cortar a lo largo de un plano sagital para exponer el aspecto interno del riñón, incluida la médula,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 60 mm x 15 mm	Sigma Aldrich	P5481	Plato de disección afilada de riñón
Papel absorbente	Fisher Científico	06-666A	Para secar el riñón antes de aplicar cola
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	El Laboratorio Jackson	13148	Ratones GCaMP3
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	El Laboratorio Jackson	24105	Ratones GCaMP6f
B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	El Laboratorio Jackson	Año 19079	Ratones smMHC-CRE
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	El Laboratorio Jackson	13148	Ratones PDGFRa-CRE
etanol	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	Para la disección
Tijeras Bonn extrafinas	Herramientas de Bellas Ciencias	14083-08	Se utiliza para tijeras de disección internas
Tijeras finas	Herramientas de Bellas Ciencias	14060-09	Se utiliza para tijeras de disección externas
Pinzas de punta fina	Herramientas de Bellas Ciencias	11254-20	Se utiliza para la disección fina del riñón
Isoflurano	Baxter	NDC 1001936060	Para la anestesia
Elastómero de silicio	Fisher Científico	NC9285739	Sylgard 184
Pinzas de Adson para estudiantes	Herramientas de Bellas Ciencias	91106-12	Para sujetar y mover suavemente el riñón
Pinzas Dumont para estudiantes	Herramientas de Bellas Ciencias	91150-20	Se utiliza para pinzas de disección internas
Tijeras de resorte Vannas	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-03	Para la disección y limpieza agudas de riñón aislado