Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparar soluciones
- Prepare 1 L de solución de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) que contenga 120,35 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 15,5 mM de NaHCO3, 1,2 mM deNa2, HPO 4,1,2 mM de MgCl2, 11,5 mM de glucosa y 2,5 mM de CaCl2. El día de uso, mantenga la solución de KRB en hielo.
nota: El KRB puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de una semana y debe preburbujearse con una mezcla de 97% deO2 y 3% deCO2 durante al menos 10 minutos antes de su uso.
>2. Seccionamiento del riñón con vibratomo
- Use pinzas de punta roma para agarrar y extraer suavemente el riñón preparado de la solución helada de KRB. Coloque inmediatamente el riñón sobre papel absorbente durante ~2-4 s para eliminar el exceso de humedad externa. Haga rodar suavemente el riñón sobre el papel absorbente para asegurarse de que todos los lados del parénquima se hayan secado para que haya una adhesión óptima del riñón a la etapa de vibratome.
NOTA: Dado que la pelvis renal se encuentra dentro del riñón y, por lo tanto, está protegida por el parénquima externo, este corto período de secado no sería perjudicial para la integridad del tejido.
- Aplique inmediatamente una capa delgada de pegamento de cianoacrilato (~ 1 cm2) en la base de la placa de muestra de vibratomo y use pinzas de punta roma para colocar el riñón, con el uréter hacia abajo, en el área cubierta de pegamento. Aplique suavemente presión hacia abajo en la parte superior del riñón con el borde plano de las pinzas durante aproximadamente 10 a 20 segundos para secar el pegamento.
nota: Para estabilizar el riñón durante este procedimiento, use un par de fórceps adicionales para mantener el riñón en posición vertical mientras se seca el pegamento. Es fundamental que el riñón se adhiera a la placa de muestra en posición vertical para que las secciones se corten rectas. Para asegurarse de que el riñón se haya adherido con éxito a la placa de muestra, empuje suavemente el costado del riñón. Si el riñón se ha adherido con éxito a la placa, la base del riñón debe permanecer asegurada a la placa.
- Asegure firmemente la placa de muestra a la parte inferior de la bandeja tampón. Ajuste el nivel de la solución de KRB para que la parte superior del riñón quede completamente sumergida. Durante los pasos de seccionamiento, a medida que la cuchilla del vibratomo se adentra más en la bandeja tampón, retire la solución KRB para que el soporte de la cuchilla no se sumerja en la solución><.
nota: Si el pegamento no se ha secado por completo antes de continuar con este paso, el pegamento a menudo se moverá hacia arriba desde la base hasta el parénquima renal. Este exceso de pegamento hará que el corte sea más variable. Si esto sucede, retire el riñón del plato y proceda con una preparación de riñón fresco.
- Para el corte automático del vibratomo, seleccione las posiciones inicial y final del ciclo de corte de la cuchilla del vibratomeo. Verifique que estas posiciones estén ~0,5-1 cm lejos del riñón para asegurarse de que, con cada avance de la cuchilla, se seccione todo el plano del riñón.
- Prepare una placa de pocillos múltiples (24 o 48 pocillos) llenando los pocillos con solución de KRB y coloque la placa en hielo.
nota: Cuando se generan, las secciones individuales deben colocarse en pozos separados para realizar un seguimiento de la profundidad de la sección.
- Inicie el proceso de corte automático. Durante la pasada inicial de la cuchilla, asegúrese de que la cuchilla haga contacto con la parte superior del riñón. Si no se hace contacto, ajuste la posición Z inicial de la cuchilla.
- Con fórceps, recoja las secciones que se liberan del riñón. Transfiera inmediatamente las secciones a pozos individuales y observe la profundidad Z de las secciones para medir la ubicación aproximada de PKJ dentro de las secciones de riñón.
nota: Dependiendo de los parámetros de corte, es posible que algunas secciones no se corten sin el bloqueo renal. Si esto ocurre, use con cuidado unas tijeras de resorte finas para cortar secciones del bloqueo renal. También se anima a los usuarios a visualizar activamente las secciones bajo un microscopio óptico mientras flotan libremente en pocillos individuales para garantizar los ajustes de corte y la ubicación óptimos del tejido. Las secciones que contienen la PKJ generalmente se derivarán ~ 1000-1500 μm de la parte superior del riñón.
- Continúe con el protocolo de seccionamiento hasta que las regiones PKJ se hagan más evidentes. Consulte la sección de resultados representativos para obtener una descripción de las regiones PKJ a medida que avanza la sección.
- En este punto, optimice los parámetros de corte para asegurarse de que las secciones se liberen del bloqueo renal de manera uniforme y estén intactas. Además, asegúrese de que las regiones de PKJ sean continuas e ininterrumpidas, ya que las paredes rotas de PKJ no permitirán obtener imágenes adecuadas de las células dentro de la pared debido al colapso. Si las paredes se rompen, disminuya la velocidad de corte y aumente el grosor de la sección y continúe observando las secciones bajo un microscopio óptico para ajustar los parámetros de corte.
- Almacene las secciones a 4 °C en una solución de KRB hasta que comience la experimentación.
