Modelo de organoide tumoral vesical: un método para el trasplante ortotópico de organoides vesicales en vejiga murina receptora

Resumen

Fuente: Kim, Y. et al. Cultivo, manipulación y trasplante ortotópico de organoides tumorales de vejiga de ratón.J. Vis. Exp.(2020)

En este video, describimos el trasplante ortotópico de organoides de tumores de vejiga cultivados a la vejiga murina para estudiar el papel del entorno de los órganos en el desarrollo de tumores.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Subcultivo de organoides tumorales de vejiga
 

NOTA: Se recomienda el paso de organoides tumorales de vejiga cuando alcancen 100-150 μm de diámetro.

1. Añadir 500 μL de colagenasa/dispasa al medio organoide en una placa de 24 pocillos con organoides tumorales. Pipetear hacia arriba y hacia abajo la matriz de la membrana basal y el medio. Incubar durante 20 min a 37 °C y recolectar las células en un tubo de 15 mL.
   nota: Examinar los organoides aislados de la matriz de la membrana basal bajo un microscopio. Si los organoides no se desprenden de la matriz de la membrana basal, aumente el tiempo de incubación o pipetee más veces.
2. Añadir 5 mL de DMEM precalentado, centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
3. Vuelva a suspender el pellet con 1 mL de tripsina-EDTA precalentada al 0,25% y 10 μM de Y-27632. Incubar durante 5 min en un baño de agua a 37 °C. Pipetear vigorosamente las células hacia arriba y hacia abajo y neutralizar la tripsina usando 5 mL de DMEM con 10% de FBS.
4. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el pellet con 1 ml de medio organoide precalentado y cuente el número de células tumorales individuales.

>2. Trasplante ortotópico de organoide vesical (Figura 1A)

1. Preparar los organoides tumorales de vejiga para el trasplante ortotópico
   1. Antes del trasplante, se cultivan los organoides del tumor vesical durante 5 a 7 días, como se describió anteriormente.
   2. Agregue 500 μL de colagenasa/dispasa al medio organoide en una placa de 24 pocillos con los organoides tumorales. Pipetear hacia arriba y hacia abajo la matriz y el medio de la membrana basal. Incubar durante 20 min a 37 °C y recoger las células en un tubo de 15 mL.
   3. Añadir 5 mL de DMEM precalentado, centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante.
   4. Vuelva a suspender el pellet con 1 mL de DMEM y transfiera la solución a una placa de Petri de 90 mm.
   5. Bajo un microscopio, recoja los 10 a 100 organoides tumorales con una micropipeta P200 y recoja en un microtubo con hielo.
   6. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C y desechar con cuidado el sobrenadante.
   7. Mantenga el gránulo de celda en hielo hasta que los ratones estén listos para la cirugía.
2. Trasplante de pared de la vejiga submucosa
   1. Prepare un ratón desnudo macho de 8 a 10 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) al menos 1 semana antes del experimento para permitirle aclimatarse a un nuevo entorno. Inyectar enrofloxacino (5 mg/kg) por vía subcutánea 24 h antes de la cirugía.
   2. Limpie la superficie del banco con agua y jabón. Esterilizar en autoclave los instrumentos quirúrgicos antes del procedimiento quirúrgico y realizar la cirugía con instrumentos estériles.
   3. Mantenga la jeringa de insulina de 29 G, las puntas de pipeta y la matriz de la membrana basal en hielo. Administrar ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea antes de la administración de la anestesia.
   4. Anestesiar al ratón con isoflurano al 4% en una cámara de inducción. Una vez lograda la anestesia general, se coloca el ratón en posición supina y se mantiene la anestesia mediante la inhalación con mascarilla de isoflurano vaporizado al 2%
      nota: Si el tiempo de anestesia es superior a 30 minutos, aplique ungüento ocular en ambos ojos con un hisopo de algodón para evitar la sequedad de la córnea.
   5. Aplique povidona yodada con una gasa estéril y límpiela con etanol al 70%. Repita 3 veces con una gasa nueva o un hisopo de algodón cada vez.
   6. Cubra el ano y el campo quirúrgico con paños quirúrgicos estériles y desechables.
   7. Usando un microscopio de disección para aumento, haga una pequeña incisión transversal (menos de 1,5 cm) en la piel y la pared muscular de la línea media inferior del abdomen con tijeras quirúrgicas estériles. Exponga la vejiga de la cavidad abdominal y apóyela con hisopos de algodón empapados en solución salina.
      nota: Si la vejiga está llena de orina, presione suavemente la vejiga para descomprimirla ligeramente.
   8. Vuelva a suspender los gránulos de organoide en 80 μL de medio organoide que contenga un 50% de matriz de membrana basal de alta concentración (Tabla 1 y Tabla de Materiales).
   9. Inyecte la suspensión de organoides en la cara anterior de la cúpula de la vejiga utilizando la jeringa de insulina de 29 G bajo un microscopio de disección.
   10. Cierre la capa interna de la pared abdominal con sutura absorbible antibacteriana y luego cierre la capa externa con sutura de nailon 4-0. Desinfectar el sitio quirúrgico con povidona yodada y etanol al 70%.
   11. Deje que el ratón se recupere bajo un irradiador infrarrojo durante 10 a 15 min. Vigile al ratón hasta que recupere la conciencia y la motilidad.
   12. Un día después de la cirugía, comprobar el estado general del ratón y la fuga anastomótica. Administrar ketoprofeno (5 mg/kg) una vez al día durante 3 días después de la operación y tratar con enrofloxacina (5 mg/kg) una vez al día durante 10 días después de la operación.
   13. Cuando el sitio de la incisión haya cicatrizado (10 a 14 días después de la cirugía), retire las suturas. Vigile el crecimiento del tumor de vejiga de ratón durante 2 a 3 semanas después de la inyección del organoide tumoral.
   14. Si se observa el crecimiento de un tumor vesical, se practica la eutanasia al ratón mediante inhalación de dióxido de carbono y se extrae todo el tumor vesical. Lávelo con DPBS frío (Figura 1B).
   15. Para analizar las características histológicas del tumor vesical, se tiñe la sección del tejido incluida en parafina mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 1B).

Medio organoide tumoral de vejiga de ratón
DMEM/F-12 avanzado (medio básico)	10 mM HEPES (pH 7,4)
10 mM de nicotinamida	0.5x Suplemento sin suero
2 mM de dipéptido L-alanil-L-glutamina	1% Penicilina/Estreptomicina
1 mM N-acetil-L-cisteína	50 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico murino
1 μM A 83-01

Tabla 1: Composición del medio organoide tumoral vesical.

Resultados

Figura 1: Trasplante ortotópico de organoides tumorales vesicales.(A) Diagrama esquemático del trasplante ortotópico de organoides tumorales de vejiga a un ratón desnudo. (B) Imágenes representativas de vejigas y secciones teñidas con H&E de ratones trasplantados ortotópicamente con organoides tumorales de vejiga. En los paneles de la izquierda s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo cónico de 15 mL	Spl	50015
Placa de 24 pocillos	Corning	3526
Jeringa de insulina de 29 G 1/2	shina	B299473538
Tubo cónico de 50 mL	Spl	50050
A8301	Tocris	Año 2939	Concentración de stock: 25 mM
Etanol absoluto	Daejung	4023-2304
Sutura reabsorbible	Henry Schein	039010
DMEM/F-12 avanzado	termo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (ratón desnudo)	Río Charles	Artículo 194
Colagenasa tipo I	termo	17100017	Concentración de existencias: 20 mg/mL
Colagenasa tipo II	termo	17100015	Concentración de existencias: 20 mg/mL
Colagenasa/dispasa	sigma	10269638001	Concentración de stock: 1 mg/mL
DMEM (Medios esenciales mínimos modificados de Dulbecco)	Gibco	11965-118
DMSO (dimetilsulfóxido)	sigma	D8418
DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco)	Welgene	LB 001-02
Matrigel factor de crecimiento reducido (GFR) factor de crecimiento reducido (GFR)	Corning	354230	Uso para el cultivo de organoides en placa
Matrigel de alta concentración (HC)	Corning	354248	Uso para el trasplante de organoides
Microtubo de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
cuchilla
Tampón salino	JW Farmacéutica
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200072
Tubo de ultracentrifugación	Beckman Coulter	331372
Y-27632 diclorhidrato	Abmole	M1817	Concentración de stock: 10 mM