Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación de sondas
- Prepare sondas de aleación de titanio-níquel (40 mm de longitud; 0,2 mm de diámetro) recubiertas con un sorbente de modo de mezcla de 7 mm. El número de sondeos depende de los puntos de tiempo destinados durante todo el procedimiento y del número de réplicas (se recomiendan 3 por punto de tiempo).
nota: La duración y el tipo de fase de extracción se pueden ajustar en función del modo de estudio, la polaridad de los metabolitos y la matriz de la muestra.
- Prepare una mezcla de limpieza compuesta por cloroformo:metanol (v/v) 2:1. Pipetear 1,0 mL de la solución en cada vial de vidrio de 2,0 mL y colocar una sonda, previamente perforada a través de la tapa, en cada vial.
nota: Antes de usar, limpie todas las sondas para eliminar las partículas contaminantes.
- Coloque los viales en el agitador y ajuste la velocidad de agitación a 1.200 rpm. Después de 45 minutos, detenga el dispositivo y enjuague los recubrimientos con agua de grado LC-MS.
- Dado que los recubrimientos deben someterse a una etapa de preacondicionamiento para activarlos, prepare una mezcla de preacondicionamiento compuesta por metanol:agua 1:1 (v/v). Pipetear 1,0 mL de la solución en cada vial de vidrio de 2,0 mL y colocar una sonda, previamente perforada a través de la tapa, en cada vial.
- Coloque los viales en el agitador de vórtice y ajuste la velocidad de agitación a 1.200 rpm.
- Después de 60 minutos, detenga el agitador y enjuague los recubrimientos con agua de grado LC-MS.
- Esterilice las sondas de acuerdo con el protocolo estándar de esterilización de equipos quirúrgicos.
>2. Extracción
- Abra el envase estéril justo antes de la toma de muestras para garantizar un entorno estéril.
- Inserte dos sondas directamente en la corteza renal durante 10 minutos en cada punto de tiempo. Toda la longitud del recubrimiento debe estar cubierta por la matriz de tejido; No se requiere un ángulo específico, pero generalmente se usa alrededor de 90 grados.
nota: Todo el procedimiento médico sigue los protocolos estándar en una institución determinada. No se tiene en cuenta ninguna modificación en relación con el muestreo SPME. El procedimiento incluye los siguientes seis puntos de tiempo de muestreo: a) antes de la resección renal, in vivo del donante; b)–e) después de 1 h, 3 h, 5 h, 7 h de perfusión renal, ex vivo en cámara de órganos; f) después de la reperfusión, in vivo desde el receptor.
- Retraiga las sondas tirando de ellas del tejido y luego enjuague los recubrimientos con agua de grado LC-MS para eliminar la sangre restante de la superficie del recubrimiento. Enjuague lejos del sitio quirúrgico e inmediatamente después de retirar las sondas.
>3. Transporte y almacenamiento
- Coloque las sondas en viales separados y ciérrelos.
- Coloque los viales en una caja de espuma de poliestireno llena de hielo seco o en nitrógeno líquido para su transporte.
- Almacene las muestras en un congelador (-80 °C) o comience inmediatamente la etapa de desorción.
>4. Desorción
- Preparar soluciones de desorción compuestas por acetonitrilo:agua 80:20 (v/v) para el análisis metabolómico y 1:1 isopropanol:metanol (v/v) para el análisis lipidómico.
- Pipetear 100 μL de la solución en los insertos colocados en viales marcados de 2,0 mL y colocar una sonda, previamente perforada a través de la tapa, en cada vial.
- Coloque los viales en el agitador de vórtice y ajuste la velocidad de agitación a 1.200 rpm durante 120 min.
- Retire las sondas de los viales. Los extractos obtenidos ya están listos para el análisis instrumental.
5. Análisis LC-MS
- Coloque los viales que contienen extractos en el muestreador automático del sistema LC-MS.
nota: Para este estudio se utilizó cromatografía líquida (RP, HILIC) junto con espectrometría de masas de alta resolución y un analizador de masas orbitrap. Para conocer los parámetros del análisis metabolómico, vaya al paso 5.2. Para conocer los parámetros del análisis lipidómico, vaya al paso 5.6.
- Utilice una columna de pentafluorofenilo (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) para la separación en fase reversa.
- Ajuste el caudal a 300 μL/min y las temperaturas del muestreador automático y de la columna a 4 °C y 25 °C, respectivamente.
- Prepare las fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: agua: ácido fórmico (99,9:0,1, v/v), y fase móvil B: acetonitrilo:ácido fórmico (99,9:0,1, v/v). Ajuste el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: comenzando el flujo de fase móvil (0-3 min): 100% A seguido de un gradiente lineal a 10% A (3-25 min), terminando con el flujo isocrático de 10% A hasta 34 min, seguido de 6 min de tiempo de reequilibrio de columna.
- Para la separación HILIC, utilice una columna HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Ajuste el caudal a 400 μL/min.
- Prepare las fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: acetonitrilo:tampón de acetato de amonio (9:1, v/v, concentración de sal efectiva 20 mM), fase móvil B: acetonitrilo:tampón de acetato de amonio (1:1, v/v, concentración de sal efectiva 20 mM).
- Ajuste el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: inicie el flujo de fase móvil (0-3 min) al 100% A, manténgalo durante 3,0 min y luego aumente al 100% B dentro de los 5 min. Mantenga con 100% B hasta 12 min, seguido de 8 min de tiempo de reequilibrio de la columna.
- Ajuste el rango de escaneo a 85–1000 m/z. Ajuste los parámetros de la fuente de iones HESI en el modo de ionización positiva a: voltaje de pulverización 1.500 V, temperatura capilar 300 °C, gas de la cubierta 40 u.a., caudal de gas auxiliar 15 u.a., temperatura del calentador de la sonda 300 °C, nivel de RF del S-Lens 55%.
- Ejecute muestras de control de calidad compuestas por 10 μl de cada muestra analizada (regularmente, cada 10-12 muestras) para monitorear el rendimiento del instrumento.
- Para la separación de fase reversa, utilice una columna C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
- Ajuste el caudal a 200 μL/min y las temperaturas del muestreador automático y de la columna a 4 °C y 55 °C, respectivamente. Prepare las fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: H2O:MeOH (60: 40, v/v), 10 mM de acetato de amonio y 1 mM de ácido acético; fase móvil B: IPA: MeOH (90:10, v/v), 10 mM de acetato de amonio y 1 mM de ácido acético.
- Ajuste el caudal de fase móvil según los siguientes parámetros: 0–1 min (20% B), 1–1,5 min (20–50% B), 1,5–7,5 min (50–70% B), 7,5–13 min (70–95% B), 13–17 min (95% B), 17–17,1 min (95–20% B), 17,1–23 min (20%).
- Para la separación HILIC, utilice una columna HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).
- Ajuste el caudal a 400 μL/min y las temperaturas del muestreador automático y de la columna a 4 °C y 40 °C, respectivamente.
- Prepare las fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: ACN; fase móvil B: 5 mM de acetato de amonio en agua. Ajuste el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: 0–2 min (96% B), 2–15 min (96–80% B), 15–15,1 min (80–96% B), 15,1–21 min (96% B).
- Ajuste los parámetros de la fuente de iones HESI en modo de ionización positiva a una tensión de pulverización de 3.500 V, temperatura capilar 275 °C, gas de la vaina 20 u.a., caudal de gas auxiliar 10 u.a., temperatura del calentador de la sonda 300 °C, nivel de RF S-Lens 55%.
- Ejecute muestras de control de calidad compuestas por 10 μL de cada muestra analizada (cada 10-12 muestras) para monitorear el rendimiento del instrumento.
- Realizar la adquisición de datos en software compatible con el instrumento.
>6. Análisis de datos
- Realice el procesamiento de datos, la identificación putativa y el análisis estadístico utilizando software dedicado al análisis metabolómico y lipidómico no dirigido.
nota: Se puede obtener análisis de componentes principales (PCA) y diagramas de bigotes de caja para visualizar la estructura de los datos.
