Tinción de ADN extracelular: un método para identificar el ADN extracelular en secciones de tejido FFPE

Resumen

Fuente: O'Sullivan, K. M. et al. Aprendizaje automático supervisado para la semicuantificación de ADN extracelular en glomerulonefritis. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe la técnica de tinción de ADN extracelular en secciones de tejido FFPE. El ADN extracelular teñido se puede cuantificar para determinar la eficacia de cualquier tratamiento terapéutico que conduzca a la muerte de las células cancerosas.

Protocolo

1. Tinción para ecDNA con DAPI y β-Actina

1. Coloque los portaobjetos de vidrio en una rejilla para portaobjetos en un horno a 60 °C durante 60 min.
2. Sumerja los portaobjetos en dos cambios de disolvente (xileno o sustituto) durante 40 minutos cada uno, en una campana extractora.
3. Rehidrate los portaobjetos en 100% etanol, 100% etanol y 70% etanol durante 5 minutos cada uno. Lavar durante 5 min con agua del grifo.
4. Coloque una placa calefactora en una campana extractora y prehierva la solución de recuperación de antígeno (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA pH 9.0) en una olla a presión. Tan pronto como la solución de recuperación de antígenos comience a hervir, coloque los portaobjetos en la olla horizontalmente con un par de pinzas y cierre la tapa. Hervir a temperatura alta (equivalente a 15 psi o 103 kPa) durante 10 min.
   nota: Este paso es crucial, ya que recupera el antígeno de interés al desenmascarar el epítopo del antígeno (reticulado a través de la fijación de formalina) para permitir la unión específica del epítopo al anticuerpo; La tinción posterior no funcionará sin él.
5. Retire la olla a presión del fuego y retire la tapa inmediatamente dejando correr el grifo frío en la parte superior de la tapa en un fregadero. Deje que los portaobjetos se equilibren durante 20 minutos en la solución de recuperación de antígenos.
6. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 min en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M (pH 7,4) en un agitador orbital.
7. Use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar círculos alrededor del tejido renal, teniendo cuidado de no dejar que ningún tejido se seque en este tiempo.
8. Bloquee el tejido en sueros de pollo al 10% en albúmina sérica bovina (BSA)/PBS al 5% (pH 7,4, 0,01 M) durante 30 min, 60 μL por sección. No lave después de este paso, pero retire con cuidado la solución de bloqueo con una pipeta de 60 μL, no deje que las secciones se sequen.
9. Aplicar cóctel de anticuerpos primarios para β-actina diluida 1/1000 al 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μL por sección e incubar durante la noche en una cámara de humedad a 4 °C.
10. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) en un agitador orbital.
11. Aplicar anticuerpo secundario, pollo anti-conejo 488 (1/200), 60 μL por sección diluido en 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) durante 40 min a RT.
12. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) en un agitador orbital.
13. Sumerja los portaobjetos en 0,3% Sudan Black en etanol al 70% durante 30 minutos en un frasco Coplin.
    nota: Este paso es importante ya que apaga la autofluorescencia causada por la fijación de formalina.
14. Lave los portaobjetos con agua del grifo para eliminar el precipitado y luego sumérjalos en PBS (pH 7,4, 0,01 M) durante 10 minutos para evitar que se formen más precipitados de Sudan Black.
15. Monte los portaobjetos en cubreobjetos de vidrio confocal utilizando tres gotas de 60 μL de solución de montaje con DAPI y selle los cubreobjetos con esmalte de uñas aplicándolo alrededor del perímetro del cubreobjetos.
16. Deje que los portaobjetos se curen durante 24 horas a RT (para permitir que el DAPI penetre) y luego almacene a 4 °C protegido de la luz.
    nota: Es importante mantenerlo en la oscuridad para evitar el desvanecimiento de las sondas fluorescentes.
17. Diapositivas de imágenes utilizando un cabezal de escaneo láser confocal conectado a un microscopio. Excite los portaobjetos con el láser 405 para DAPI y el láser 488 para beta actina. Capture imágenes de un solo plano de 1024 x 1024 píxeles mediante la captura secuencial de líneas y el promedio de 4 líneas, que es esencial para detectar ECDNA. Se utiliza un objetivo de aceite 40x 1.0 NA.
    1. Obtener una imagen de un mínimo de 20 glomérulos por muestra. Guarde las imágenes como archivos ND2.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina	sigma	A2153	Las soluciones al 5% y al 1% se componen en PBS, se pueden hacer a granel y congelarse, se desechan una vez descongeladas
Anticuerpo de absorción cruzada IgG (H+L) anti cabra de pollo Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Gire en la mini centrífuga durante 1 minuto antes de usar para evitar cualquier conjugado libre en su cóctel de anticuerpos
Anticuerpo de absorción cruzada IgG (H+L) anti ratón de pollo, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Gire en la mini centrífuga durante 1 minuto antes de usar para evitar cualquier conjugado libre en su cóctel de anticuerpos
Anticuerpo de absorción cruzada IgG (H+L) anti conejo de pollo Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Gire en la mini centrífuga durante 1 minuto antes de usar para evitar cualquier conjugado libre en su cóctel de anticuerpos
Sueros de pollo	sigma	C5405	Compuesto por un 1% de BSA/PBS
Cubreobjetos 24x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Este no es un espesor estándar diseñado para su uso en microscopía confocal
EDTA 10mM	sigma	E6758	Agregue TRIS y EDTA juntos en agua destilada y pH a 9, para la recuperación de antígenos, se puede preparar en una solución 10x
Etanol 30%, 70% y 100%	Suministro de productos químicos	UN1170	Se suministra como etanol 100% sin desnaturalizar: diluido al 30% y al 70% con agua destilada
Formaldehído, 4% (10% Formalina tamponada neutra)	Trajan	NBF-500	El riñón se coloca en un tubo de 5 ml que contiene 3 ml de formalina durante 16 horas en RT, la formalina debe usarse en una campana extractora
Portaobjetos de histología de vidrio - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	Trajan	J3800AM4	El uso de portaobjetos recubiertos con carga positiva es esencial. No se recomienda el uso de poli-L-lisina para el recubrimiento de portaobjetos, ya que el tejido se desprende de los portaobjetos durante la etapa de recuperación del antígeno
Anticuerpo MPO anti humano/ratón	I+d	AF3667	Alícuota y congelación a menos 80 grados a la llegada
Bolígrafo hidrofóbico	Laboratorios VECTOR	H-400	Úselo para dibujar un círculo alrededor del tejido renal
Solución salina tamponada con fosfato	sigma	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl Componen 5L a la vez
Olla a presión 6L Tefal secure 5 Neo inoxidable	Tefal	GSA-P2530738	Comprado en la tienda local de artículos para el hogar
Prolongar el DAPI de oro	Tecnologías de la Vida	P36962	Aplique las gotas directamente sobre el cubreobjetos
Anticuerpo Beta Actina anti humano/ratón	ABCAM	AB8227	Alícuota y congelación a menos 80 grados a la llegada
Anticuerpo H3Cit anti humano/ratón de conejo	ABCAM	AB5103	Alícuota y congelación a menos 80 grados a la llegada
Bandeja de tinción 24 portaobjetos	ProScitech	H4465	La rejilla de tinción elegida debe ser capaz de soportar la ebullición a presión y la incubación en un horno a 60 grados
Sudán Negro B	sigma	199664	0,3% Añadir 3 g a una botella de 1 litro en etanol al 70%, filtrar y proteger de la luz - estable durante 6 meses a temperatura ambiente
Tris 10mM	sigma	T4661	Agregue TRIS y EDTA juntos en agua destilada y el pH a 9, para la recuperación de antígenos, se puede preparar en una solución 10x
xileno	Trajan	XL005/20	Debe usarse en una campana extractora